本文關(guān)鍵詞：腺苷預(yù)處理對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一章大鼠脊髓缺血再灌注模型的建立目的建立大鼠脊髓缺血再灌注模型。方法選取15只成年健康雄性SD大鼠作預(yù)實(shí)驗(yàn),選取15只成年健康雄性SD大鼠作正式實(shí)驗(yàn)。大鼠10%水合氯醛麻醉,固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。手術(shù)過(guò)程中以烤燈保溫,使肛溫維持在38℃左右。腹部手術(shù)區(qū)備皮,消毒,取腹正中線(xiàn)作切口,暴露腹主動(dòng)脈,分別游離左腎動(dòng)脈下及左、右髂總動(dòng)脈分叉以上的腹主動(dòng)脈。尾靜脈注射肝素抗凝。動(dòng)脈夾夾閉腹主動(dòng)脈上、下端,90 min后開(kāi)放,逐層關(guān)腹。術(shù)后肌注青霉素預(yù)防感染。大鼠完全清醒后放入單籠飼養(yǎng)。于再灌注6、12、24h觀(guān)察大鼠并對(duì)其后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分,0分,后肢無(wú)活動(dòng),不能負(fù)重；1分,后肢可見(jiàn)活動(dòng)但不能負(fù)重；2分,后肢活動(dòng)頻繁或有力,不能負(fù)重；3分,后肢可支持體重,能走1-2步；4分,可行走,僅有輕度障礙；5分,行走正常。取再灌注24h大鼠的L2-L5節(jié)段脊髓組織作HE染色。結(jié)果15例預(yù)實(shí)驗(yàn)中,有9例存活,6例死亡。在成功建立的9例模型中,再灌注6h的Tarlov評(píng)分為0.78+0.83,再灌注12h的Tarlov評(píng)分為1.11+0.60,再灌注24h的Tarlov評(píng)分為1.67±0.70。15例正式實(shí)驗(yàn)中,15例均存活。再灌注6h的Tarlov評(píng)分為0.93+0.79,再灌注12h的Tarlov評(píng)分為1.60±0.51,再灌注24h的Tarlov評(píng)分為2.00±0.655。脊髓缺血再灌注6h后可見(jiàn)神經(jīng)元腫脹,胞漿淡染,染色質(zhì)邊集。脊髓缺血再灌注12h可見(jiàn)神經(jīng)元腫脹程度嚴(yán)重,胞漿有大量空泡形成,部分神經(jīng)元核仁不清,周?chē)g隙增寬。脊髓缺血再灌注24h可見(jiàn)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷,較12h損傷程度重。結(jié)論通過(guò)阻斷大鼠腎動(dòng)脈水平的腹主動(dòng)脈90min成功建立大鼠脊髓缺血再灌注模型。第二章 腺苷預(yù)處理對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注后bcl-2、bax、 GRP-78、caspase 12表達(dá)的影響目的截癱是胸腹大動(dòng)脈手術(shù)后的一種嚴(yán)重并發(fā)癥,其發(fā)生的主要原因是脊髓缺血再灌注損傷,尤其是夾閉胸腹主動(dòng)脈所致的遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞死亡。為了減少這一并發(fā)癥的發(fā)生,人們采取了多種措施：控制缺血時(shí)間,脊髓缺血段的降溫,腦脊液引流,脊髓旁組織灌注預(yù)冷溶液以及應(yīng)用抗氧化劑或其他藥物等。腺苷作為心臟外科手術(shù)中的保護(hù)劑,可減輕心肌再灌注損傷,但其能否減輕術(shù)后脊髓損傷仍有待研究。通過(guò)觀(guān)察腺苷對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注后細(xì)胞凋亡及B細(xì)胞白血病/淋巴瘤-2(bcl-2)、B細(xì)胞白血病/淋巴瘤-2相關(guān)蛋白X(bax)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白-78(GRP-78)和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶12(caspase 12)表達(dá)的影響,探討其對(duì)脊髓損傷的保護(hù)作用。方法27只成年健康雄性SD大鼠隨機(jī)分成3組：對(duì)照組(A組)；缺血再灌注組(B組)；腺苷預(yù)處理組(C組)。大鼠10%水合氯醛麻醉,固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。手術(shù)過(guò)程中以烤燈保溫,使肛溫維持在38℃左右。腹部手術(shù)區(qū)備皮,消毒,取腹正中線(xiàn)作切口,暴露腹主動(dòng)脈,分別游離左腎動(dòng)脈下及左、右髂總動(dòng)脈分叉以上的腹主動(dòng)脈。尾靜脈注射肝素抗凝。動(dòng)脈夾夾閉腹主動(dòng)脈上、下端,90 min后開(kāi)放,逐層關(guān)腹。術(shù)后肌注青霉素預(yù)防感染。大鼠完全清醒后放入單籠飼養(yǎng)。于再灌注6、12、24h觀(guān)察大鼠并對(duì)其后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分,0分,后肢無(wú)活動(dòng),不能負(fù)重；1分,后肢可見(jiàn)活動(dòng)但不能負(fù)重；2分,后肢活動(dòng)頻繁或有力,不能負(fù)重；3分,后肢可支持體重,能走1-2步；4分,可行走,僅有輕度障礙；5分,行走正常。取L2-L5節(jié)段脊髓,置于4%多聚甲醛中固定,作蘇木素-伊紅(HE)染色,Nissl染色,并在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察。取各組脊髓標(biāo)本石蠟連續(xù)切片各1張,脫蠟,蛋白酶K孵育,加入TUNEL反應(yīng)液孵育,然后滴加Converter-POD溶液孵育。二氨基苯聯(lián)胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,封片后光鏡觀(guān)察。將2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定后的脊髓移入4℃的1%鋨酸溶液中固定1h,乙醇、丙酮梯度脫水,環(huán)氧樹(shù)脂包埋聚合,制作成超薄切片,醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙重染色,于H-600型透射電鏡下觀(guān)察脊髓中神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)和固相免疫測(cè)定法。用電子天平稱(chēng)取各組脊髓標(biāo)本100mg,剪碎,加入裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF),用組織勻漿器勻漿,將其4℃離心得到上清,即總蛋白。測(cè)定蛋白濃度后,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,聚偏氟乙烯(PVDF)膜進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)印,封閉液封閉。加入稀釋好的bcl-2一抗(1：1000)、bax一抗(1：4000)、GRP-78一抗(1：3000)、caspase 12—抗(1：1000)4℃過(guò)夜,以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體作為內(nèi)參照,洗膜后分別加入相應(yīng)的羊抗兔二抗(1：5000)室溫孵育1 h,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色劑顯色。應(yīng)用Gelpro32軟件分析結(jié)果條帶的積分吸光度,計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。RT-qPCR檢測(cè)：Trizol提取細(xì)胞總RNA,用總RNA 4.0μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,體系中分別加入bcl-2、bax、β-actin基因的引物,合成的cDNA直接用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：94℃變性3 min后,94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃30 s,30次反復(fù)循環(huán)擴(kuò)增,最后72℃延伸10 min。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20.0 μl,反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s,60℃退火20 s,72℃延伸30 s,44個(gè)循環(huán)。溶解曲線(xiàn)分析溫度設(shè)定為72.0℃-94.0℃。PCR反應(yīng)在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-rad公司)上進(jìn)行,擴(kuò)增曲線(xiàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及溶解曲線(xiàn)由儀器自動(dòng)繪制。采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物,序列如下：bcl-2引物序列：上游：5’-CGACTTTGCAGAGATGTCCA-3’,下游：5’-ATGCCGGTTCAGGTACTCAG-3',223bp；bax引物序列：上游：5’-CTGCAGAGGATGATTGCTGA-3',下游：5'-GATCAGCTCG GGCACTTTAG-3',174bp；GRP-78引物序列：上游：5'-TGACTCCAGCAGAGCCCTAT-3’,下游： 5’-TTGGGAGAACCATTGAGAGG- 3',197bp；caspase12引物序列：上游：5’GCTGCCAAGAGAACACATGA-3',下游：5’--GGTTCTCAGCTTTGCTCAGG-3',1 69bp；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物序列：上游：5'-TGCCACTCAGAA GACTGTGG-3’,下游：5'-TTCAGCTCTGGGATGAC CTT-3',129bp.在GAPDH作內(nèi)參照條件下,檢測(cè)bcl-2和bax mRNA的表達(dá)。結(jié)果HE染色及NISSL染色結(jié)果：A組神經(jīng)元胞體大,胞漿豐富,染色均勻,無(wú)出血水腫,未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),尼氏體著色正常；B組可見(jiàn)神經(jīng)元腫脹,胞漿淡染,部分神經(jīng)元核仁不清,周?chē)g隙增寬,尼氏體不清；C組神經(jīng)元胞體輪廓清晰,核仁清晰,周?chē)g隙增寬,但損傷較B組明顯減輕。電鏡檢測(cè)結(jié)果：A組可見(jiàn)細(xì)胞核核膜完整,染色質(zhì)分布均勻,核周細(xì)胞器正常,髓鞘排列規(guī)律整齊,軸索均勻一致；B組細(xì)胞核皺縮,染色質(zhì)邊集,髓鞘松散,軸索與髓鞘間有孔隙,空泡多見(jiàn)；C組細(xì)胞核核膜完整,染色質(zhì)分布均勻,髓鞘完整但稍松散,軸索均勻,基質(zhì)中少見(jiàn)空泡。TUNEL染色結(jié)果：A組神經(jīng)元染色均勻,偶見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞；B組可見(jiàn)大量含紫藍(lán)色顆粒的陽(yáng)性細(xì)胞,C組陽(yáng)性細(xì)胞較B組少。Western blot檢測(cè)結(jié)果： bcl-2蛋白在B組表達(dá)最弱,C組比B組蛋白表達(dá)水平增高。bax蛋白在B組表達(dá)最強(qiáng),與B組相比,C組蛋白表達(dá)水平降低。C組bcl-2/bax表達(dá)水平高于B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。A組bcl-2/bax表達(dá)水平高于B、C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。C組GRP-78蛋白表達(dá)水平高于B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。B組、C組caspase 12蛋白表達(dá)均高于A(yíng)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。C組 caspase12蛋白表達(dá)水平低于B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果：凋亡抑制基因bcl-2在B組表達(dá)最弱, C組較B組表達(dá)量增高。凋亡基因bax在B組表達(dá)最強(qiáng),與B組相比,C組表達(dá)量降低。C組bcl-2/bax表達(dá)水平高于B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。A組bcl-2/bax表達(dá)水平高于B、C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。GRP-78在B組表達(dá)最弱, C組較B組表達(dá)量增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。凋亡基因caspase 12在B組表達(dá)最強(qiáng),與B組相比,C組表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論再灌注24h后,腺苷預(yù)處理組脊髓組織中凋亡細(xì)胞較缺血再灌注組少,說(shuō)明腺苷可以抑制細(xì)胞凋亡。腺苷預(yù)處理組脊髓組織中bcl-2/bax表達(dá)水平高于脊髓缺血再灌注組,說(shuō)明腺苷可以通過(guò)上調(diào)bcl-2的表達(dá),降低bax的表達(dá),進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。腺苷還能通過(guò)上調(diào)GRP-78的表達(dá),下調(diào)caspase 12的表達(dá),抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生,進(jìn)一步抑制脊髓神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡
【關(guān)鍵詞】：脊髓 缺血再灌注 腹主動(dòng)脈 模型 大鼠 缺血再灌注 細(xì)胞凋亡 腺昔 bcl-2 bax GRP-78 caspase 12
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R651.2
【目錄】：

• 中文摘要3-8
• Abstract8-15
• 引言15-21
• 參考文獻(xiàn)18-21
• 第一部分 大鼠脊髓缺血再灌注模型的建立21-29
• 第一節(jié) 材料和方法21-24
• 第二節(jié) 結(jié)果24-25
• 第三節(jié) 討論25-27
• 參考文獻(xiàn)27-29
• 第二部分 腺苷預(yù)處理對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注后bcl-2、bax、GRP-78、caspase 12表達(dá)的影響29-44
• 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料29-30
• 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法30-36
• 第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-41
• 第四節(jié) 討論41-44
• 全文總結(jié)44
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 英文縮略詞表49-50
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果50-51
• 附件51-69
• 致謝69-70

【共引文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：腺苷預(yù)處理對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：457522