本文關(guān)鍵詞：雷帕霉素在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后空間記憶功能保護(hù)作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是常見的致死、致殘性疾病,損傷后可出現(xiàn)認(rèn)知記憶障礙、行為異常等變化,是目前影響人類健康的世界性難題。隨著我國經(jīng)濟(jì)與交通的快速發(fā)展,創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)生率也同比增加。盡管創(chuàng)傷性腦損傷的救治體系和方案不斷完善,但其死殘率仍居高不下。而目前創(chuàng)傷性腦損傷的損傷機(jī)制仍不清楚,因此,進(jìn)一步深入研究創(chuàng)傷性腦損傷的病理分子機(jī)制將成為神經(jīng)外科領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。近來,自噬(Autophagy)作為神經(jīng)細(xì)胞另一種程序性死亡方式越來越受到關(guān)注,但其具體機(jī)制尚不清楚。自噬是通過溶酶體機(jī)制和微管系統(tǒng)等共同作用的一種代謝途徑。它在神經(jīng)元中起清除和再利用細(xì)胞成分的作用,并參與多種病理生理過程。創(chuàng)傷性腦損傷后,啟動自噬可保護(hù)受傷的神經(jīng)細(xì)胞,避免其趨向死亡,及時(shí)清除已損害的細(xì)胞、毒性興奮性氨基酸、自由基及代謝廢物等,對損傷后或應(yīng)激狀態(tài)下神經(jīng)細(xì)胞的存活起著重要的作用。雷帕霉素(Rapamycin)是經(jīng)典的mTOR受體抑制劑,通過特異地抑制mTORC1從而介導(dǎo)下游自噬信號途徑的激活,其中,mTOR受體在自噬的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。近年來,雷帕霉素激動自噬在神經(jīng)細(xì)胞損傷后的保護(hù)作用也逐漸被人們認(rèn)識并引起重視。在本研究中,(一)、應(yīng)用大鼠側(cè)方液壓腦損傷模型,傷后6周大鼠空間記憶功能出現(xiàn)障礙,損傷側(cè)海馬組織自噬相關(guān)蛋白明顯減少；(二)、給予自噬激動劑雷帕霉素后,TBI后6周,大鼠空間記憶功能改善；(三)、TBI后應(yīng)用雷帕霉素大鼠損傷側(cè)海馬組織自噬增強(qiáng),神經(jīng)細(xì)胞凋亡抑制。第一部分中型創(chuàng)傷性腦損傷后大鼠空間記憶功能和自噬變化一、目的：(1)構(gòu)建中型側(cè)方液壓腦打擊損傷大鼠模型；(2)驗(yàn)證TBI后大鼠認(rèn)知空間記憶的改變；(3)觀察TBI后大鼠損傷側(cè)海馬組織自噬變化；二、材料和方法：1、成年雄性SD大鼠,體重(190±15)g,飼養(yǎng)3周后,體重為(350±20)g,大鼠行開顱鉆孔手術(shù),鉆孔中心位于前囟后4.5mm,中線旁開左側(cè)3mm,鉆孔直徑0.5cm,切開頭皮,移除骨窗,避免損傷硬膜,采用磷酸鋅水門汀齒科固定材料固定液壓打擊處,連接液壓打擊儀,給予2.12±0.03倍大氣壓強(qiáng)度打擊；假手術(shù)對照組(Sham)只切開皮膚,鉆孔后縫合。傷后每日記錄大鼠體重并描繪變化曲線,對于體重減輕超過體重50%以上或感染嚴(yán)重或?yàn)l死的大鼠,退出實(shí)驗(yàn)。2、成年雄性SD大鼠25只,按照隨機(jī)數(shù)字表法分為TBI組,數(shù)量為15只；假手術(shù)組(Sham),數(shù)量為10只。3、傷后6周,第36-40天行Morris水迷宮測試,訓(xùn)練總天數(shù)為5天,分為空間記憶定位測試、空間探索功能測試兩部分,主要檢測大鼠損傷后短期記憶及空間探索能力,用于評估TBI后大鼠學(xué)習(xí)和記憶存儲功能變化。4、行為學(xué)測試最后一天(傷后40天),分別隨機(jī)抽取不同組別大鼠,待麻醉滿意后,迅速斷頭,冰上取損傷側(cè)海馬組織(30s內(nèi)),進(jìn)一步提取總蛋白并檢測。配置體積分?jǐn)?shù)為15%分離膠,行SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,放入封閉液中封閉,后將PVDF膜放入分別含一抗內(nèi)參p-actin (1:5000)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)(1：1000)、自噬相關(guān)蛋白Beclin-1 (1：500)雜交袋中,置于4。搖床過夜,用PBST洗膜3次,每次5 min,后孵育結(jié)合熒光二抗1.5 h,再次避光洗膜3次后熒光掃膜顯色。觀察自噬相關(guān)蛋白表達(dá)差異。三、結(jié)果：1、Morris水迷宮數(shù)據(jù)提示中型創(chuàng)傷性腦損傷可導(dǎo)致大鼠空間記憶功能障礙(p0.05)。水迷宮實(shí)驗(yàn)第5天,TBI組與Sham組相比,潛伏期P(入水至找到逃生平臺所需時(shí)間)明顯縮短(P0.05)�？臻g探索測試結(jié)果提示,TBI組較假手術(shù)組在目標(biāo)象限滯留時(shí)間明顯縮短(P0.05),表現(xiàn)出區(qū)域偏好性差或不存在。2、Western-blot結(jié)果提示,傷后6周,TBI組與Sham組比較,損傷側(cè)海馬組織自噬蛋白Beclin-1和LC3出現(xiàn)明顯下降(P0.05)。四、結(jié)論：1、中度TBI后,大鼠海馬結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷,伴隨空間記憶功能障礙；2、損傷側(cè)海馬組織在TBI后期(損傷后40天)自噬減弱。第二部分雷帕霉素誘導(dǎo)自噬對中型創(chuàng)傷性腦損傷大鼠認(rèn)知功能的影響目的：通過mTORCl受體抑制劑雷帕霉素,誘導(dǎo)損傷側(cè)海馬組織自噬增強(qiáng),觀察大鼠空間記憶功能變化。材料和方法：應(yīng)用成年雄性SD大鼠中型創(chuàng)傷性腦損傷模型,方法同前。雄性成年SD大鼠84只,體重(190±15g),飼養(yǎng)3周后,體重為(350±20)g,準(zhǔn)備工作同前,84只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組：第1組(CTR+DMSO組,數(shù)量=12)；第2組(CTR+Rapamycin組1.5 mg/kg,數(shù)量=13)；第3組(Sham+DMSO組,數(shù)量=12)；第4組(Sham+Rapamycin組1.5 mg/kg,數(shù)量=12)；第5組(TBI+DMSO組,數(shù)量=18)；第6組(TBI+Rapamycin組1.5mg/kg,數(shù)量=17)。給藥方式：TBI后30min內(nèi)為首次給藥時(shí)間,后連續(xù)2周間隔24小時(shí)給藥。TBI后第36-40天行Morris水迷宮測試,方法同前。結(jié)果Morris水迷宮數(shù)據(jù)證明：大鼠TBI后,Rapmycin組比較DMSO組,潛伏期P明顯縮短(13.82s VS 6.0s, P0.05); DMSO組則出現(xiàn)明顯的空間記憶功能障礙(19.75s VS 7.75s,P0.05)；而Sham組與CTR組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(6.75s VS7.5s,P0.05)。結(jié)論給予雷帕霉素激動自噬后,大鼠空間記憶功能得到改善；第三部分雷帕霉素對中型創(chuàng)傷性腦損傷大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬與凋亡的影響目的：通過mTORC1受體抑制劑雷帕霉素誘導(dǎo)損傷側(cè)海馬組織自噬增強(qiáng),觀察海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬與凋亡變化。材料和方法：行為學(xué)測試最后一天(傷后40天),按照隨機(jī)數(shù)字表法抽取大鼠(TBI+Rapmycin)組8只,(TBI+DMSO)組9只,(Sham+Rapmycin)組6只,(Sham+DMSO)組6只,(CTR+Rapmycin)組6只,(CTR+DMSO)組6只,麻醉后斷頭取損傷側(cè)海馬組織行Western-blot檢測自噬變化,方法同前；剩余大鼠則提取完整腦組織,經(jīng)4%多聚甲醛固定后經(jīng)石蠟包埋,自前囟后2.31mm至前囟后4.9mm連續(xù)冠狀切片,厚度設(shè)定為4μ m。腦組織觀察區(qū)域限定為損傷同側(cè)腦組織海馬結(jié)構(gòu)(CA3)區(qū)。通過免疫組化、免疫熒光以及凋亡TUNEL觀察不同組別損傷側(cè)海馬組織CA3區(qū)損傷后期神經(jīng)細(xì)胞自噬水平及凋亡細(xì)胞數(shù)量差異。結(jié)果1、Western-blot、免疫組化及免疫熒光結(jié)果提示中度TBI后6周,損傷側(cè)海馬組織自噬水平明顯下降(P0.01),雷帕霉素治療組可提升損傷側(cè)海馬組織自噬水平。證明了本課題所選擇治療劑量、給藥方式及治療時(shí)間窗效果肯定；2、Western-blot及免疫組化、免疫熒光、TUNEL凋亡檢測提示：(TBI+Rapmycin)組損傷側(cè)海馬組織自噬明顯增強(qiáng),且神經(jīng)細(xì)胞凋亡抑制,海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目減少(P0.05)。結(jié)論損傷后雷帕霉素可通過增強(qiáng)自噬,減低損傷側(cè)海馬組織凋亡水平,抑制海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡而起到腦保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：創(chuàng)傷性腦損傷 自噬 Morris水迷宮 海馬 神經(jīng)細(xì)胞 雷帕霉素 自噬 認(rèn)知 雷帕霉素 自噬 凋亡
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R651.15
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 英文縮略詞15-17
• 前言17-18
• 第一部分、中型創(chuàng)傷性腦損傷后大鼠空間記憶功能和自噬變化18-33
• 引言18
• 材料和方法18-27
• 結(jié)果27-30
• 實(shí)驗(yàn)討論30-31
• 參考文獻(xiàn)31-32
• 實(shí)驗(yàn)小結(jié)32-33
• 第二部分、雷帕霉素誘導(dǎo)自噬對中型創(chuàng)傷性腦損傷大鼠空間記憶功能的影響33-38
• 引言33
• 材料和方法33-35
• 結(jié)果35-36
• 實(shí)驗(yàn)討論36-37
• 參考文獻(xiàn)37
• 實(shí)驗(yàn)小結(jié)37-38
• 第三部分、雷帕霉素對中型創(chuàng)傷性腦損傷大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬與凋亡的影響38-45
• 引言38
• 材料和方法38-41
• 結(jié)果41-43
• 實(shí)驗(yàn)討論43-44
• 參考文獻(xiàn)44
• 實(shí)驗(yàn)小結(jié)44-45
• 全文結(jié)論45-46
• 綜述46-49
• 參考文獻(xiàn)47-49
• 碩士在讀期間發(fā)表論文及科技成果49-50
• 致謝50

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：437486