本文關鍵詞：二氫辣椒堿通過抑制Foxa2和增強LXRα下調HepG2中apoM的表達，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景二氫辣椒堿(dihydrocapsaicin, DHC)和辣椒素(capsaicin)占紅辣椒提取物中辣椒素類物質的85-90%。已證實DHC可以加速人和嚙齒類動物碳水化合物代謝、能量消耗和脂質代謝,且已成功用于治療和緩解一些臨床癥狀,如周圍神經炎引起的疼痛、類風濕性關節(jié)炎和骨關節(jié)炎等。有研究表明定期攝入紅辣椒可以在體外增加脂蛋白的抗氧化能力和在體內調節(jié)餐后高胰島素血癥等情況,這些機體的變化提示DHC可能有助于降低心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)的風險。Adam等研究發(fā)現(xiàn)DHC和capsaicin可以在體外抑制血小板的聚集和凝血因子Ⅷ和Ⅸ的活化,可能有助于抑制動脈血栓的形成和防治心血管疾病。此外,我們課題組研究表明,DHC可通過PPARy/LXRa途徑抑制高脂飲食的apoE-/-小鼠主動脈粥樣斑塊的形成,這些結果提示DHC與心血管疾病,特別是動脈粥樣硬化的防治密切相關。載脂蛋白M(apoliprotein M, apoM)屬于Lipocalin蛋白超家族成員,主要由肝臟及腎臟組織產生。肝臟中的apoM主要存在于肝細胞,絕大部分肝臟中的apoM分泌入血漿并整合到脂蛋白中,對apoM在血漿脂蛋白中分布的研究發(fā)現(xiàn),絕大部分apoM分布在高密度脂蛋白(High density lipoprotein, HDL)中(96%apoM存在于HDL),極少數(shù)的apoM也存在于低密度脂蛋白(Low densitylipoprotein, LDL)、極低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein, VLDL)和甘油三酯(Triglyceride, TG)等脂蛋白中。研究表明,apoM在Prep-HDL的形成和細胞內膽固醇流出至HDL中起著重要作用,采用RNA干擾技術將小鼠apoM基因沉默后,小鼠肝臟和血漿中apoM的表達減少,apoM表達減少后可以導致血漿中Prep-HDL缺失,使得血漿中HDL的濃度降低。Lee等研究發(fā)現(xiàn),糖尿病兔動物模型中血漿apoM的濃度和肝臟apoM mRNA的表達水平顯著下降,提示糖尿病動物模型中apoM的低表達可能由于高血糖導致的。這些研究結果提示apoM在動脈粥樣硬化和糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。轉錄因子叉頭框蛋白A2(forkhead box A2, Foxa2),基因定位于染色體20p11.21,是參與肝臟葡萄糖穩(wěn)態(tài)和脂質代謝的轉錄因子。Foxa2在低胰島素水平時定位于細胞核并可轉錄激活誘導脂肪酸氧化和酮體生成相關基因的轉錄和促進VLDL的分泌以及膽汁酸的代謝。當血漿胰島素水平升高時,激活胰島素受體,Foxa2發(fā)生磷酸化反應且從細胞核中排出,其轉錄活性受到抑制。已有研究表明,轉錄因子Foxa2與apoM啟動子的結合位點在-474。高胰島素小鼠肝臟組織apoM的表達和血漿Prep-HDL的減少是由于Foxa2的失活所致。對野生型小鼠和糖尿病模型ob/ob小鼠尾靜脈注射突變型不能被磷酸化的Foxa2后,不僅能促進小鼠肝臟葡萄糖和脂質的代謝,還能上調apoM的表達。反之,Foxa2單倍劑量不足的Foxa2+/-小鼠肝臟的apoM表達水平與血漿Preβ-HDL、HDL的濃度顯著下調,提示Foxa2可以調控apoM的轉錄表達。肝X受體(Liver X Receptor, LXR)是膽固醇代謝的主要轉錄因子,LXRa主要在脂質代謝活躍的組織如白脂肪組織、肝臟、小腸、脾、腦垂體和巨噬細胞中表達,可參與調節(jié)脂質的代謝平衡。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)apoM基因是受LXRa調控的靶基因之一,LXR激動劑T0901317在體內外均能顯著降低apoM的表達,進一步研究發(fā)現(xiàn),用T0901317處理小鼠后,小鼠血漿中apoM表達水平明顯降低。相同的是,在HepG2細胞培養(yǎng)過程中加入T0901317也會下調apoM的表達。這些研究結果提示,apoM是LXR調控的靶基因之一,且T0901317聯(lián)合9-順式視黃酸能顯著下調apoM的表達,表明LXR/RXR(視黃醛受體)途徑與LXR調控apoM表達相關。但是,DHC是否可影響apoM的表達及其相關作用機制尚未見相關文獻報道,Foxa2和LXRa是否參與DHC調控apoM的表達尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)。DHC可通過抑制Foxa2和增強LXRa下調HepG2細胞中apoM的表達。研究方法1、DHC的配制DHC為脂溶性物質,溶于無水乙醇溶液中,配置成初濃度為1mol/L的儲存液,接著用無菌生理鹽水按不同濃度要求0、25、50、100uM進一步溶解稀釋,最終DHC的工作液中乙醇濃度為0.1%,同時以等體積的含有0.1%乙醇的生理鹽水作為空白對照處理細胞,工作液都是在處理細胞前現(xiàn)配現(xiàn)用。2、細胞培養(yǎng)HepG2細胞生長于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中,37℃、5%C02恒溫細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中加入1% 100 U/ml的青霉素和100pg/mL的鏈霉素,每隔2-3天傳代一次,取對數(shù)生長期細胞進行實驗。細胞接種在6孔板或12孔板中,待其生長到匯合度達60-80%進行處理。3、實驗動物8周齡的雌性C57BL/6小鼠10只,均重20g,隨機分為2組,每組5只：(1)對照組,用不含膽固醇的植物油灌胃處理(0.2ml/只),1次/天；(2)DHC處理組,用溶解有DHC的無膽固醇的植物油灌胃處理(0.2 ml/只,按DHC3.0mg/kg的劑量),1次/天。飼養(yǎng)條件為每籠5只,室溫25℃,正常飼料飼喂并給予每12小時光照/黑暗循環(huán)。1周后,對動物進行麻醉,頸椎脫臼法處死小鼠后分離肝臟組織進行后續(xù)實驗。4、RNA提取和實時熒光定量PCRTRIzol試劑盒提取培養(yǎng)細胞和小鼠肝臟組織的總RNA,將1μg總RNA用逆轉錄試劑盒反轉錄成20μl cDNA。實時定量PCR在ABI 7500FAST上進行,溶解曲線分析表明PCR反應是否特異,以GAPDH表達量為內參并以△△Ct方法定量mRNA的相對表達量。5、免疫印跡(Western blot analyses)蛋白提取試劑盒提取細胞及小鼠肝臟組織的蛋白,對蛋白提取物定量后向蛋白提取物中加入5X的SDS,混勻并煮沸10分鐘,冷卻后置冰箱待用。10%瓊脂糖凝膠電泳分離目的蛋白,按說明書要求依次電泳、轉膜、封閉后以兔多克隆抗APOM、Foxa2、LXRa和β-actin一抗孵育過夜,洗滌孵育二抗再洗滌后,以化學發(fā)光法顯示條帶,檢測目的蛋白的相對表達量。6、轉染小分子RNAHepG2細胞接種在6孔板(2×106/孔),待細胞貼壁后用Lipo2000轉染Foxa2、LXRa和空載siRNA,Trizol收集并裂解細胞,提取總RNA用于mRNA檢測,收集總蛋白用于免疫印跡的檢測。7、構建重組質粒通過PCR將PCR-XL-TOPO和PIRES2-EGFP2個片段拼接為EcoRI-Foxa2-IRES-EGFP-XhoI或EcoRI-LXRa-IRES-EGFP-XhoI的全長目的片段,并將其連接到pcDNA3.1,構建重組質粒pcDNA3.1-Foxa2或pcDNA3.1-LXRα。通過Lipo2000將重組質粒轉染到培養(yǎng)的細胞中,Trizol收集并裂解細胞,提取總RNA用于mRNA檢測,收集總蛋白用于免疫印跡的檢測。8、統(tǒng)計分析計量數(shù)據以x±s表示,各基因mRNA相對表達量、各蛋白免疫印跡條帶相對灰度值的比較采用單因素方差分析。每組實驗重復3次,采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據分析,P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。結果1、DHC可濃度和時間依賴性減少HepG2細胞中apoM基因和蛋白的表達水平。ApoM主要在肝細胞及腎小管上皮細胞中表達,肝細胞合成的apoM可分泌入血,與血漿中的脂蛋白結合,血漿中96%的apoM存在于HDL。我們首先檢測DHC對HepG2細胞中的apoM表達的影響,用0、25、50、100uM DHC分別處理HepG2細胞24小時,熒光定量PCR與免疫印跡的結果顯示DHC可濃度依賴性減少HepG2細胞中的apoM mRNA和蛋白的表達水平；用100uM DHC處理HepG2細胞后0、6、12、24h檢測apoM基因和蛋白的表達水平,熒光定量PCR與免疫印跡的結果顯示DHC可時間依賴性減少HepG2細胞中的apoM mRNA和蛋白的表達。2、Foxa2參與DHC介導的HepG2細胞中apoM的表達下調。以往研究表明,Foxa2是一種參與肝臟葡萄糖代謝的轉錄因子,apoM受Foxa2的直接調控,因此我們檢測Foxa2是否參與DHC介導的HepG2細胞中apoM的表達下調。熒光定量PCR與免疫印跡的結果顯示DHC可濃度依賴性減少HepG2細胞中的Foxa2 mRNA和蛋白的表達。接著我們采用小分子RNA干擾技術敲減HepG2細胞的Foxa2,Foxa2表達量減少了87%。Foxa2 siRNA處理HepG2細胞后,DHC抑制apoM表達的效應更加顯著；相反,用重組的Foxa2質粒過表達HepG2細胞后,Foxa2表達量增加了565%。Foxa2重組質粒處理HepG2細胞的Foxa2后,DHC抑制apoM表達的效應被部分抵消。3、DHC通過增加LXRa來下調HepG2細胞中apoM的表達。已有研究表明,用LXR激動劑T0901317處理HepG2細胞后,apoM mRNA表達水平顯著下調,且T0901317處理小鼠后,小鼠血漿中apoM表達水平也出現(xiàn)明顯降低。因此我們檢測LXRa是否參與DHC介導的HepG2細胞中apoM的表達下調。熒光定量PCR與免疫印跡的結果顯示DHC可濃度依賴性增加HepG2細胞中的LXRa mRNA和蛋白的表達。采用小分子RNA干擾技術敲減HepG2細胞的LXRa后,LXRa表達量減少了91%,免疫印跡的結果顯示LXRa siRNA處理后DHC抑制apoM的表達被部分逆轉；相反,用重組的LXRa質粒處理HepG2細胞后,LXRa表達量增加了617%,過表達LXRa后DHC抑制apoM表達的效應更加明顯。4、DHC可下調小鼠肝臟組織apoM的表達。肝臟是主要產生和降解血液循環(huán)中含apoM脂蛋白的組織器官,我們在體外實驗已證實,DHC可以通過抑制Foxa2和增強LXRa來減少HepG2細胞中的apoM基因和蛋白的表達,因此我們下一步檢測DHC對C57BL/6小鼠肝組織apoM、Foxa2和LXRa的影響。10只雌性的C57BL/6小鼠隨機分成兩組,(1)對照組,用無膽固醇的植物油灌胃處理(0.2ml/只),1次/天；(2)DHC組,用溶含有DHC的無膽固醇的植物油灌胃處理(0.2 ml/只,DHC 3.0mg/kg),1次/天。一周后麻醉,頸椎脫臼法處死小鼠,取小鼠肝臟組織進行免疫印跡的測定,結果顯示,與對照組相比,DHC灌胃處理C57BL/6小鼠后,肝臟apoM的表達減少、LXRa表達增加并且Foxa2表達減少。結論1、DHC可濃度和時間依賴性減少HepG2細胞中apoM基因和蛋白的表達水平。2、DHC可濃度依賴性減少HepG2細胞中的Foxa2 mRNA和蛋白的表達,采用RNA干擾技術敲減Foxa2后,DHC抑制apoM表達的效應更加顯著；過表達Foxa2后,DHC抑制apoM表達的效應被部分抵消。3、DHC可濃度依賴性增加HepG2細胞中的LXRa mRNA和蛋白的表達,采用RNA干擾技術敲減LXRa后,DHC抑制apoM的表達被部分逆轉；過表達LXRa后,DHC抑制apoM表達的效應更加明顯。4、DHC灌胃處理C57BL/6小鼠后,肝臟apoM的表達減少、LXRa表達增加并且Foxa2表達減少。
【關鍵詞】：二氫辣椒堿 載脂蛋白M Foxa2 肝X受體α
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R543.5
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-22
• 材料和方法22-41
• 1. 實驗材料22-26
• 2. 主要溶液的配制方法26-27
• 3. 實驗方法27-41
• 實驗結果41-53
• 1. DHC可減少HepG2細胞中的apoM mRNA和蛋白的表達水平41-43
• 2. Foxa2參與DHC介導的HepG2細胞中apoM的表達下調43-47
• 3. DHC通過增加LXRa來下調HepG2細胞中apoM的表達47-51
• 4. DHC對小鼠肝臟組織apoM表達的影響51-53
• 討論53-59
• 參考文獻59-65
• 全文小結65-66
• 英文縮寫詞一覽表66-67
• 綜述67-76
• 參考文獻72-76
• 攻讀學位期間成果76-78
• 致謝78-79

【共引文獻】

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  本文關鍵詞：二氫辣椒堿通過抑制Foxa2和增強LXRα下調HepG2中apoM的表達，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：346435