本文關(guān)鍵詞：交泰丸鎮(zhèn)靜催眠作用的靶標(biāo)代謝組學(xué)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：課題來源：國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目《基于“腦微透析-藥動學(xué)／藥效學(xué)”的交泰丸“配伍生新”機(jī)制研究》(基金項(xiàng)目編號：81173564)目的：采用腦微透析技術(shù)采樣,研究給藥交泰丸后正常大鼠和對氯苯丙氨酸(PCPA)誘導(dǎo)的失眠模型大鼠海馬組織的神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)變化。利用靶標(biāo)代謝組學(xué)的方法,研究交泰丸對PCPA誘導(dǎo)的大鼠失眠模型的干預(yù)作用,探討交泰丸鎮(zhèn)靜催眠作用的作用機(jī)制。方法：1.建立同時測定腦微透析樣品中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物的LC-MS/MS方法建立同時測定腦微透析樣品中多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)、5-羥色胺(5-HT)、3,4-二羥基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、3-甲氧基-4-羥基苯乙二醇(MHPG)和5-羥基吲哚乙酸(5-HIAA)七個神經(jīng)遞質(zhì)的LC-MS/MS方法。采用丹磺酰氯(DNS)作為衍生化試劑,對衍生化的條件進(jìn)行優(yōu)化；優(yōu)化色譜、質(zhì)譜條件,對方法的專屬性、線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性進(jìn)行考察。2.交泰丸對正常大鼠和PCPA誘導(dǎo)的失眠模型大鼠海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)影響用水合氯醛麻醉大鼠,切開大鼠頭皮,用顱骨鉆打孔。然后利用大鼠腦立體定位儀,將導(dǎo)管植入大鼠大腦海馬組織中(AP:-5.2mm,ML:+4.5 mm;DV:-3.8 mm),并用螺絲和牙科水泥固定導(dǎo)管。大鼠恢復(fù)7天后,把導(dǎo)管的芯取出,將探針通過導(dǎo)管植入到海馬組織中。將大鼠置于大鼠清醒裝置,連接好泵。用人工腦脊液以2 μL/min的流速灌注,平衡2 h,開始取樣,共取4個樣,作為神經(jīng)遞質(zhì)基礎(chǔ)水平測定的樣品。然后灌胃給藥交泰丸,劑量為黃連提取物300 mg/kg,肉桂油4.7 mg/kg。藥物混懸于0.5%的羧甲基纖維素鈉中。給藥后繼續(xù)收集樣品,每15 min收集一個樣品,共收集10h。收集的樣品全部保存于-80℃冰箱。樣品按照已經(jīng)建立的測定方法測定神經(jīng)遞質(zhì)的濃度。然后分析數(shù)據(jù),得出結(jié)論。3.建立同時測定氨基酸、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和嘌呤嘧啶的親水色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HILIC-MS/MS)方法針對內(nèi)源性物質(zhì)極性大的特點(diǎn),采用HILIC-MS/MS的方法對24種氨基酸、4種神經(jīng)遞質(zhì)和8中嘌呤嘧啶進(jìn)行含量測定。分別比較在乙腈和正常大鼠血清、乙腈和正常大鼠腦組織勻漿液作為基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,考察采用乙腈作為基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品是否合理。對色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化,對方法的線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度、加樣回收率進(jìn)行考察。4.交泰丸對PCPA誘導(dǎo)的失眠模型大鼠干擾的靶標(biāo)代謝組學(xué)研究將18只大鼠隨機(jī)分為3組,正常組,PCPA模型組,PCPA模型給藥組。PCPA模型組和PCPA模型給藥組在第1天腹腔注射PCPA 300mg/kg,在第2天和第3天,注射腹腔PCPA100 mg/kg,復(fù)制PCPA失眠模型。第4天開始,PCPA模型給藥組灌胃給予交泰丸,正常組和PCPA模型組給予相應(yīng)體積的0.5%的CMC-Na溶液。實(shí)驗(yàn)第7天,在給藥6小時后,取血0.5mL,放置30min后,5000 rpm離心10min,分離血清,立刻放置-80℃保存,待測。在第10天,給藥6小時后,用腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠,取血清,然后斷頭處死大鼠,在冰臺迅速分離腦組織,腦組織立刻放置-80℃保存。血清樣本和腦組織樣本采用已經(jīng)建立的方法進(jìn)行測定。利用SIMCA-P+(version 12.0,Umetrics,Umea, Sweden)進(jìn)行PCA和PLS-DA多元統(tǒng)計分析,結(jié)合T檢驗(yàn)篩選出差異的代謝物。將發(fā)現(xiàn)的差異代謝物,用Metabo Analyst 3.0進(jìn)行代謝通路分析,進(jìn)一步結(jié)合HDMB、KEEG等數(shù)據(jù)庫解析差異代謝物的生物學(xué)意義。結(jié)果：1.建立了同時測定腦微透析樣品中DA、NE、5-HT、DOPAC、HVA、MHPG和5-HIAA的LC-MS/MS。其樣品衍生化的條件溫和,反應(yīng)時間短。方法的專屬性、線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性符合生物樣品分析方法的要求；方法快速、靈敏,適合微透析樣品中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物的分析。2.本研究采用活體腦微透析采樣技術(shù),研究了交泰丸對正常大鼠和PCPA誘導(dǎo)的失眠模型大鼠的多種神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)影響。結(jié)果顯示,交泰丸影響了海馬組織細(xì)胞間的多種神經(jīng)遞質(zhì)的代謝。其影響主要是在一定時間內(nèi)增加了神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物的濃度。3.建立了包括氨基酸、神經(jīng)遞質(zhì)和嘌呤嘧啶共37化合物的HILIC-MS/MS方法。方法的線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度、加樣回收率符合生物樣品分析方法的要求。其方法樣品處理簡單,靈敏度高,分析時間短,適合用于交泰丸治療PCPA誘導(dǎo)的失眠模型大鼠的靶標(biāo)代謝組學(xué)研究。4.模型組和給藥組的血清中5-HT濃度明顯低于正常組血清中5-HT的濃度,PCPA模型復(fù)制成功。交泰丸對PCPA模型大鼠的干擾作用與逆轉(zhuǎn)PCPA導(dǎo)致的代謝紊亂有關(guān),主要與作用可能與下調(diào)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的代謝、多巴胺代謝、谷氨酸谷氨酰胺代謝等代謝通路有關(guān)。此外,還可能與對甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、組氨酸代謝和精氨酸和脯氨酸代謝的影響有關(guān)。然而,交泰丸不影響PCPA模型大鼠的5-HT代謝通路,其對PCPA的治療作用與5-HT代謝通路無關(guān)。結(jié)論：微透析技術(shù)和代謝組學(xué)技術(shù)可以應(yīng)用于交泰丸的藥理作用研究；單次給藥交泰丸可以增加大鼠海馬組織的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物的濃度,其起效時間快,持續(xù)時間在6h左右；藥交泰丸可以改善PCPA導(dǎo)致的代謝紊亂,主要與與下調(diào)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的代謝、多巴胺代謝、谷氨酸谷氨酰胺代謝等代謝通路有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：交泰丸 神經(jīng)遞質(zhì) 靶標(biāo)代謝組學(xué) 失眠 液質(zhì)聯(lián)用
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R285.5
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 引言11-12
• 第一章 文獻(xiàn)研究12-19
• 1.1 交泰丸藥理研究進(jìn)展12-14
• 1.2 神經(jīng)遞質(zhì)與睡眠的關(guān)系14-15
• 1.3 神經(jīng)遞質(zhì)測定方法研究進(jìn)展15-16
• 1.4 微透析在中藥研究中的應(yīng)用16-17
• 1.5 代謝組學(xué)在中藥研究的應(yīng)用17-19
• 第二章 建立同時測定腦微透析樣品中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物的LC-MS/MS方法19-28
• 2.1 前言19
• 2.2 儀器與材料19
• 2.2.1 儀器19
• 2.2.2 對照品和試劑19
• 2.3 方法19-21
• 2.3.1 對照品溶液的配制19-20
• 2.3.2 樣品衍生化處理20
• 2.3.3 色譜和質(zhì)譜條件20
• 2.3.4 方法學(xué)驗(yàn)證20-21
• 2.4 結(jié)果與討論21-27
• 2.4.1 樣品處理21-23
• 2.4.2 色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化23-25
• 2.4.3 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果25-27
• 2.5 結(jié)論27-28
• 第三章 交泰丸正常大鼠和PCPA誘導(dǎo)的失眠模型大鼠海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)影響28-32
• 3.1 前言28
• 3.2 儀器與材料28
• 3.2.1 儀器28
• 3.2.2 試藥28
• 3.2.3 動物28
• 3.3 方法28-29
• 3.3.1 黃連提取物和肉桂油的制備28-29
• 3.3.2 導(dǎo)管植入手術(shù)29
• 3.2.3 PCPA模型復(fù)制29
• 3.2.4 活體微透析采樣29
• 3.4 結(jié)果與討論29-32
• 第四章 建立同時測定氨基酸、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和嘌呤嘧啶的HILIC-MS/MS方法32-46
• 4.1 前言32
• 4.2 儀器與材料32
• 4.2.1 儀器32
• 4.2.2 對照品和試劑32
• 4.3 方法32-35
• 4.3.1 對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制32-33
• 4.3.2 色譜和質(zhì)譜條件33-35
• 4.3.3 方法學(xué)驗(yàn)證35
• 4.4 結(jié)果與討論35-45
• 4.4.1 方法的建立35
• 4.4.2 色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化35-38
• 4.4.3 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化38-39
• 4.4.4 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果39-45
• 4.5 結(jié)論45-46
• 第五章 交泰丸對PCPA模型大鼠干預(yù)的靶標(biāo)代謝組學(xué)研究46-59
• 5.1 前言46
• 5.2 儀器與材料46
• 5.2.1 儀器46
• 5.2.2 對照品和試劑46
• 5.2.3 試藥46
• 5.2.4 動物46
• 5.3 方法46-47
• 5.3.1 動物實(shí)驗(yàn)47
• 5.3.2 樣品處理與測定47
• 5.3.3 數(shù)據(jù)處理47
• 5.4 結(jié)果與討論47-59
• 5.4.1 PCPA模型復(fù)制評價47-48
• 5.4.2 多變量統(tǒng)計分析結(jié)果48-50
• 5.4.3 代謝差異物識別50-55
• 5.4.4 差異代謝物生物學(xué)意義解析55-59
• 結(jié)語59-60
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 在校期間發(fā)表論文情況66-67
• 致謝67-68
• 附件168

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：交泰丸鎮(zhèn)靜催眠作用的靶標(biāo)代謝組學(xué)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：310129