【摘要】：研究背景乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤,在過去的幾十年里,乳腺癌的病例數(shù)量穩(wěn)步增長。在世界范圍內(nèi),乳腺癌是導致癌癥死亡的第五大最常見的原因,在女性人群中,它是導致癌癥死亡的第二大最常見的原因。外科手術(shù)在乳腺癌的診斷、分析及綜合治療中發(fā)揮著重要作用。人們也更加關(guān)注手術(shù)后是否能降低癌癥復發(fā)和轉(zhuǎn)移的風險。圍手術(shù)期間最常用的麻醉藥物之一便是七氟烷。因其獨特的優(yōu)點被廣大麻醉工作者及各個年齡段的患者所接受。七氟烷無刺激性,臨床上常規(guī)使用的濃度不燃不爆,血氣分配系數(shù)低,在血中溶解度小,肺泡中的氣體濃度升高快,麻醉誘導過程迅速,被廣泛用于全身麻醉的誘導和維持。七氟烷還具有抑制炎癥反應,誘導細胞凋亡的作用,對腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程具有一定的抑制作用。微RNA(miRNA)是一種小的非編碼RNA,可通過與信使RNA(mRNA)的3'端結(jié)合來調(diào)控基因的表達。越來越多的研究也表明miRNAs可影響腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲。miRNA在不同疾病背景下的特殊作用在很大程度上依然是未知的。miR-203也曾被報道為早期檢測宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在標志物。然而,七氟烷是否或如何調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的發(fā)生發(fā)展及信號傳導過程現(xiàn)在還不清楚,本研究可能揭示七氟烷對乳腺癌的調(diào)節(jié)作用,提示miRNA可能是乳腺癌預防和治療的潛在靶點。研究目的本課題旨在研究七氟烷是否通過抑制microRNA-203水平抑制乳腺癌細胞增殖。材料與方法乳腺癌細胞是從中國科學院細胞培養(yǎng)庫購買,RPMI-1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。實驗分三個部分進行。第一部分隨機將細胞分為Ctrl組、Sevoflurane組,研究七氟烷對乳腺癌細胞增殖的作用。第二部分隨機將細胞分為miR-203 Ctrl組、miR-203組、miR-203 inhibitor Ctrl組、miR-203 inhibitor組,探究miR-203對乳腺癌增殖的作用。第三部分為挽救實驗,隨機將細胞分為Ctrl組、Sevoflurane組、Sevoflurane+miR-203 inhibitor組。需七氟烷處理的細胞暴露于2%七氟烷6小時。采用MTS法檢測細胞的增殖能力,使用溴脫氧尿苷(Brd U)摻入試驗分析計數(shù)Brd U陽性細胞數(shù),采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測細胞周期相關(guān)基因cyclin D,cyclin E和細胞周期抑制基因Rb1,P21,P27的表達量,Western Blot技術(shù)分析細胞周期相關(guān)基因cyclin D,cyclin E和細胞周期抑制基因Rb1,P21,P27的相對表達量。使用流式細胞術(shù)檢測乳腺癌細胞中各個細胞周期的細胞比例。結(jié)果(1)七氟烷抑制乳腺癌細胞的增殖與Ctrl組相比,Sevoflurane組的乳腺癌細胞的增殖能力受到抑制,細胞周期相關(guān)基因cyclin D,cyclin E的表達水平明顯下降,細胞周期抑制基因Rb1,P21,P27的表達水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),表明七氟烷可抑制乳腺癌細胞的增殖能力。(2)七氟烷處理后的乳腺癌細胞miR-203水平上調(diào)且miR-203抑制乳腺癌細胞的增殖與Ctrl組相比,Sevoflurane組的乳腺癌細胞miR-203的表達上調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);用pre-miR-203轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞發(fā)現(xiàn)miR-203明顯抑制細胞增殖,相反,轉(zhuǎn)染miR-203抑制劑的癌細胞能促進癌細胞的增殖,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);miR-203組細胞周期相關(guān)基因cyclin D,cyclin E的表達水平明顯下降,細胞周期抑制基因Rb1,P21,P27的表達水平升高,miR-203inhibitor組細胞周期相關(guān)基因cyclin D,cyclin E的表達水平明顯上調(diào),細胞周期抑制基因Rb1,P21,P27的表達水平下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),證實七氟烷處理后的癌細胞中miR-203水平上調(diào),且miR-203有抑制乳腺癌細胞增殖的能力。(3)miR-203抑制劑能挽救七氟烷對乳腺癌細胞的作用用轉(zhuǎn)染miR-203抑制劑的癌細胞經(jīng)七氟烷處理,其抑制癌細胞增殖的能力與Ctrl組相似,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);與Sevoflurane組相比,Sevoflurane+miR-203 inhibitor組抑制癌細胞增殖作用不明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);與Ctrl組相比,Sevoflurane+miR-203 inhibitor組細胞周期相關(guān)基因cyclin D,cyclin E及細胞周期抑制基因Rb1,P21,P27的表達水平無差異性(P0.05),與Sevoflurane組相比,Sevoflurane+miR-203 inhibitor組細胞周期相關(guān)基因cyclin D,cyclin E表達上調(diào),細胞周期抑制基因Rb1,P21,P27的表達下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),充分證明miR-203抑制劑能挽救七氟烷對乳腺癌細胞的作用。結(jié)論七氟烷可通過抑制microRNA-203的水平抑制乳腺癌細胞增殖。
【圖文】：

圖 1：(A) MTS 檢測顯示經(jīng)七氟烷處理的 MDA-MB-231(左)和 MCF-7(右)細胞增殖能力受到抑制。Ctrl 組是指沒有七氟烷處理的對照組。(B) Brd U 摻入法表明經(jīng)七氟烷處理的MDA-MB-231 細胞的增殖能力受到抑制。(C) RT-qPCR 檢測細胞周期相關(guān)基因(cyclin E、cyclin D、P21、P27、Rb1)表達水平。經(jīng)七氟烷處理過的細胞 cyclin E、cyclin D 表達下調(diào)，P21、P27、Rb1 表達上調(diào)。(D)流式細胞術(shù)檢測 MDA-MB-231 細胞，七氟烷導致細胞周期在 G1 期停止。數(shù)據(jù)用均值±標準差表示 (n =3-8)。*P<0.05， **P<0.01。

P21、P27、Rb1 表達上調(diào)，在轉(zhuǎn)染 mi R-203 抑制劑的細胞中，這些指標下調(diào)(圖2D 和 E)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。流式細胞術(shù)測定顯示，當 MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染 pre-mi R-203 時，G1 期細胞比例增加，在 S 期和 G2/M 期呈下降趨勢(圖2F)。而轉(zhuǎn)染 mi R-203 抑制劑后，G1 期細胞比例降低，S 期和 G2/M 期比例升高(圖 2F)。證實七氟烷處理后的癌細胞中 miR-203 水平上調(diào)，且 miR-203 有抑制乳腺癌細胞增殖?
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R614;R737.9

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