【摘要】：目的:每年都有成千上萬的嬰幼兒接受全身麻醉。全身麻醉是否對兒童的神經(jīng)發(fā)育和認(rèn)知功能產(chǎn)生不良影響是近年來備受關(guān)注的話題,也存在爭議。許多臨床前研究表明,麻醉劑會引起發(fā)育期的神經(jīng)損傷,突觸可塑性及神經(jīng)細(xì)胞凋亡,并影響成人學(xué)習(xí)和記憶功能。越來越多的臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明,麻醉劑會引起大腦的認(rèn)知功能障礙和形態(tài)學(xué)改變,特別是當(dāng)它們用于未成熟和老年大腦時(shí)。雖然幾種可能的機(jī)制已經(jīng)被提出,包括氧化損傷和神經(jīng)細(xì)胞凋亡,但神經(jīng)毒性的具體機(jī)制仍不十分清楚。許多研究也一直致力于能夠減輕麻醉藥神經(jīng)毒性的方法。Hemin是血紅素氧化的產(chǎn)物,也稱為氯化血紅素、氯化卟啉鐵和亞鐵血紅素,能夠誘導(dǎo)血紅素氧化酶活性,具有廣泛的生物學(xué)功能。一般認(rèn)為氯化血紅素具有神經(jīng)保護(hù)作用,可以誘導(dǎo)腦紅蛋白(Ngb)的表達(dá)。腦紅蛋白也有神經(jīng)保護(hù)的作用,抵抗缺血/缺氧損傷,并抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Hemin的神經(jīng)保護(hù)作用在腦缺血和創(chuàng)傷性腦損傷中已成為關(guān)注熱點(diǎn)。然而,hemin對麻醉藥引起的神經(jīng)毒性的作用和機(jī)制尚未闡明。盡管研究表明七氟烷能引起線粒體動力學(xué)的改變,但hemin對七氟烷引起的線粒體動力學(xué)改變的影響尚不清楚,因此,在本實(shí)驗(yàn)中,我們研究了七氟烷神經(jīng)毒性的線粒體機(jī)制以及hemin是否可以緩解新生大鼠七氟烷暴露所致的認(rèn)知功能障礙。Hemin是HO-1的底物和誘導(dǎo)劑,HO-1也具有神經(jīng)保護(hù)作用。Hemin通過誘導(dǎo)Nrf2依賴性抗氧化劑,如血紅素加氧酶-1(HO-1)、硫氧還蛋白-1(TRX-1)和過氧還蛋白-2(PRX-2)發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。Hemin可以防止自由基引起的損傷,降低興奮性氨基酸毒性,對重要器官缺氧缺血性損傷具有重要的保護(hù)作用。但hemin是否通過PI3K/Akt途徑參與新生鼠七氟烷神經(jīng)毒性的保護(hù)作用仍不十分清楚。所以我們通過腦室注射PI3K/Akt的特異性抑制劑LY294002(LY)來研究PI3K/Akt途徑是否參與hemin神經(jīng)保護(hù)的過程。同時(shí)用Western blot檢測Ngb,caspase-3,Akt,pAkt,HO-1及SOD的變化來觀察hemin對七氟烷毒性的保護(hù)作用的其他可能機(jī)制。研究方法:7日齡健康SD大鼠84只,體重16-18g。將新生大鼠隨機(jī)分為4組;(1)對照組(C組):僅腹腔注射生理鹽水,并吸入40%氧氣和60%氮?dú)獾幕旌蠚怏w。(2)氯化血紅素給藥組(H組),在生后第5天和第6天腹腔注射hemin(50mg·kg~(-1));(3)S組:吸入3%的七氟烷約(1.5MAC)4小時(shí),吸入氧濃度40%,氮?dú)?0%。(4)SH組中吸入3%的七氟烷4小時(shí),并在生后第5天和第6天腹腔注射hemin(50mg·kg~(-1))。抑制劑組分組:7日齡健康SD大鼠24只,體重16-18g。將生后七天的新生大鼠隨機(jī)分為4組;(1)對照組(C組):僅腹腔注射生理鹽水,并吸入40%氧氣和60%氮?dú)獾幕旌蠚怏w。(2)氯化血紅素給藥組(H組),在生后第5天和第6天腹腔注射hemin(50mg·kg~(-1));(3)SH組中吸入3%的七氟烷4小時(shí),并在生后第5天和第6天腹腔注射hemin(50mg·kg~(-1))。(4)SHI組中吸入3%的七氟烷4小時(shí),并在生后第5天和第6天腹腔注射hemin(50mg·kg~(-1)),同時(shí)在麻醉前兩小時(shí)側(cè)腦室注入LY294002 3μl。麻醉后18小時(shí)用Western blot檢測cleaved caspase-3,TUNEL檢測用于檢測海馬細(xì)胞凋亡,細(xì)胞色素C用于檢測線粒體功能,Drp1,Mfn2測定線粒體動力學(xué),免疫組化檢測neuroglobin的表達(dá),免疫熒光雙染檢測neuroglobin的表達(dá)分布和定位,同時(shí)用Western blot檢測neuroglobin,Akt,pAkt,觀察七氟烷對pAkt的影響以及hemin是否通過PI3K/Akt這一通路起作用。檢測HO-1及SOD的表達(dá),從氧化應(yīng)激角度觀察七氟烷的神經(jīng)毒性及hemin的保護(hù)作用。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)用于檢測生后30天大鼠的認(rèn)知功能并用Western blot檢測PSD-95及GAP-43的表達(dá)。結(jié)果:1七氟烷引起海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的增加并引起線粒體動力學(xué)平衡失調(diào),氧化應(yīng)激反應(yīng)增加,吸入3%的七氟烷4小時(shí)會引起大鼠認(rèn)知功能障礙。同對照組比較,七氟烷組新生SD大鼠海馬內(nèi)cleaved caspase-3、細(xì)胞色素c、HO-1、Drp1及neuroglobin的表達(dá)增加,Mfn2、pAkt、SOD的表達(dá)下降,象限停留時(shí)間減少(P0.05)。同S組相比,TUNEL檢測SH組凋亡細(xì)胞數(shù)減少(P0.05)。SH組凋亡細(xì)胞數(shù)與C組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2 Hemin引起腦紅蛋白的表達(dá)升高,減少了七氟烷暴露引起的海馬區(qū)細(xì)胞的凋亡,改善線粒體動力學(xué),減少氧化應(yīng)激損傷,改善七氟烷暴露引起的認(rèn)知障礙。同七氟烷組比較,七氟烷+hemin組的cleaved caspase-3、細(xì)胞色素c、Drp1的表達(dá)下降,Mfn2、pAkt、SOD的表達(dá)升高,象限停留時(shí)間延長(P0.05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,在給予hemin后,同C組比較,其它三組新生大鼠海馬CA1區(qū)域中Ngb的光密度值增加(P0.05)。免疫熒光雙染結(jié)果表明,Ngb主要定位于神經(jīng)元,少部分定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞。3氯化血紅素通過PI3K/Akt途徑緩解了新生SD大鼠七氟烷暴露引起的凋亡。同其他三組比較,抑制劑組pAkt/Akt明顯下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。而cleaved caspase-3的表達(dá)明顯增加(P0.05)。4同C組和S組比較,我們發(fā)現(xiàn)H組和SH組PSD-95的表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。同C組比較,S組GAP-43表達(dá)降低,同S組比較,SH組GAP-43表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5抑制劑Ly294002并未對腦紅蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響。結(jié)論:Hemin可以減少新生SD大鼠海馬區(qū)細(xì)胞的凋亡,改善線粒體的功能失調(diào),減輕七氟烷吸入引起的新生大鼠認(rèn)知功能的損傷及生長相關(guān)蛋白43的改變。另外,Hemin通過上調(diào)血紅素氧合酶HO-1的表達(dá)緩解了七氟烷吸入引起的超氧化物歧化酶SOD水平的下將,從而增強(qiáng)了新生SD大鼠的抗氧化防御反應(yīng),保護(hù)其免受七氟烷暴露帶來的氧化應(yīng)激損傷。而hemin可能通過PI3K/Akt信號通路起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。另外腦紅蛋白的表達(dá)并未受影響,提示PI3K/Akt可能是腦紅蛋白下游的信號傳導(dǎo)途徑。
【圖文】：

組織化學(xué)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 dUTP 缺口末端標(biāo)記（TUNEL）測定。取 36 只新生雄性大鼠并飼養(yǎng)到生后 30 天用于 Morris 水迷宮測試。行為學(xué)測試僅選取雄性大鼠以避免由動情周期引起的潛在的變異性。將雄性幼鼠與其母鼠一起飼養(yǎng)至 3 周齡然后分籠飼養(yǎng)至 30 天。2.2.2 分組7 日齡健康 SD 雄性鼠 84 只，體重 16-18g。隨機(jī)分為 4 組：（1）對照組（C 組）：僅腹腔注射同等體積的生理鹽水，并吸入 40％氧氣和 60％氮?dú)獾幕旌蠚怏w;（2）氯化血紅素給藥組（H 組），在生后第 5 天和第 6 天腹腔注射 hemin（50mg·kg-1）;（3）七氟烷組（S 組）：吸入 3%的七氟烷約（1.5MAC）4 小時(shí)，吸入氧濃度 40%，氮?dú)?0%；（4）七氟烷+hemin 組 生后第 5 天和第 6 天腹腔注射 hemin（50mg·kg-1）SH組中吸入 3％的七氟烷 4 小時(shí)，并在生后第 5 天和第 6 天腹腔注射 hemin（50mg·kg-1）。

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文5圖 2 實(shí)驗(yàn)流程示意圖2.2.3 腹腔給藥將新生鼠仰臥，用左手食指和中指夾住兩上肢，用拇指和無名指夾住兩下肢，，選取肚臍以下平面左側(cè)腹腔進(jìn)針，用 1ml 注射器針頭以 30°角進(jìn)針，針尖斜向頭側(cè)，有落空感后回抽無血液給予 hemin 腹腔注射。對照組給予同樣劑量的生理鹽水。2.2.4 藥物制備Hemin（Sigma,美國）粉末避光保存于棕色瓶中。用天平稱取 300mg hemin 并溶于 10ml0.1MNaOH 氫氧化鈉溶液中，用旋渦振蕩器震蕩 30min，使其充分溶解。然后用 0.1M 鹽酸調(diào)節(jié) pH 值至 7.4，并用鹽水稀釋至所需體積 30ml[19]。分裝在 1.5ml的EP管中凍存于-20℃冰箱。根據(jù)既往研究選取50mg·kg-1的劑量進(jìn)行腹腔注射[20]。2.3 實(shí)驗(yàn)方法與組織制備2.3.1 麻醉處理在自制的 40cm×30cm×40cm 的麻醉箱中以 40%的氧氣作為載體吹入 3%的七氟烷，該箱可以密閉，兩側(cè)分別有進(jìn)出氣體的管路，箱中有鈉石灰吸收過多的二氧化碳，頂部有玻璃門方便拿取大鼠。用水浴箱維持麻醉箱內(nèi)的溫度在 30±1℃。使用麻醉氣體監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測麻醉深度在 1.5MAC。麻醉開始將七氟烷的揮發(fā)罐開到 8%，直到麻醉監(jiān)護(hù)儀中的 MAC 值達(dá)到 1.5
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R726.1

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本文編號：2605131