發(fā)布時(shí)間：2017-03-20 21:11

  本文關(guān)鍵詞：七氟醚通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)幼年大鼠海馬不同亞區(qū)的不同損傷作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景及目的:七氟醚是一種經(jīng)典的吸入性麻醉藥,近年來(lái)由于其具有起效快,易復(fù)蘇以及麻醉深度易調(diào)控等特點(diǎn),七氟醚被廣泛應(yīng)用于臨床手術(shù)麻醉。而且在老年人、中青年人以及兒童等各年齡段患者中均可適用,尤其在兒童全麻誘導(dǎo)及維持中有顯著優(yōu)點(diǎn),因此兒童成為其重要的適用群體[1]。但是,眾所周知,到目前為止無(wú)論是靜脈麻醉藥還是吸入性麻醉藥,其作用機(jī)制都尚不明了[2]。對(duì)于這樣一種作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物,在方便手術(shù)操作的同時(shí),他的安全性越來(lái)越成為人們關(guān)注的焦點(diǎn),特別是對(duì)幼年兒童的神經(jīng)發(fā)育是否有不利影響更是成為醫(yī)療工作者亟待解決的一個(gè)問(wèn)題。早期對(duì)于吸入性麻醉藥的研究主要集中在其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用上[3-5],有研究表明,七氟醚能夠促進(jìn)大鼠腦缺血區(qū)的細(xì)胞存活,而且能夠減輕大腦再灌注損傷[6]。還有學(xué)者認(rèn)為,七氟醚預(yù)處理能夠減輕缺血缺氧對(duì)大鼠大腦的損害[5,7]。這些都為七氟醚的臨床應(yīng)用安全性提供了支持。但是,已經(jīng)有越來(lái)越多的研究逐漸證實(shí),七氟醚等吸入性麻醉藥存在一定程度的神經(jīng)毒性,并且對(duì)兒童認(rèn)知能力的發(fā)育有著不可忽視的影響。大量研究證實(shí),七氟醚等吸入性麻醉藥能夠誘導(dǎo)小鼠大腦皮層及海馬等眾多腦區(qū)發(fā)生細(xì)胞凋亡[8,9],更重要的是,如果將幼年大鼠暴露于七氟醚后,其成年后的空間認(rèn)知能力明顯低于正常小鼠[10]。然而,吸入性麻醉藥造成神經(jīng)毒性的機(jī)制到目前為止也尚不明了。有研究表明,吸入性麻醉藥神經(jīng)毒性的產(chǎn)生可能與其過(guò)度激活了γ氨基丁酸A型受體受體(GABAR)有關(guān)[11,12]。最近有人提出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能也是其神經(jīng)毒性的重要機(jī)制之一[13]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)一種重要的細(xì)胞器,他對(duì)細(xì)胞的存活、蛋白合成、胞內(nèi)鈣平衡等眾多生理過(guò)程起著調(diào)節(jié)作用[14]。一旦其功能紊亂會(huì)引發(fā)諸多疾病。當(dāng)缺氧、鈣失衡、毒物刺激等損傷因素作用于細(xì)胞后,會(huì)誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,從而引起錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)累積及鈣超載,最終引起細(xì)胞生理功能紊亂甚至凋亡[15,16]。雖然之前的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能與七氟醚引起的大腦細(xì)胞凋亡有關(guān),然而經(jīng)歷七氟醚暴露的幼年大鼠海馬是否也會(huì)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激?七氟醚引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在大鼠海馬不同類型的細(xì)胞中是否會(huì)造成不同的損傷?根據(jù)這一理論是否可以研究出一種預(yù)防七氟醚神經(jīng)毒性的策略呢?因此,本課題圍繞上述這一系列問(wèn)題展開(kāi)了研究,目的是進(jìn)一步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在七氟醚對(duì)幼年大鼠海馬的損傷中作用,以及探討通過(guò)抑制麻醉過(guò)程中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用。方法:本實(shí)驗(yàn)主要由三個(gè)部分組成,第一部分首先用七氟醚處理小鼠海馬神經(jīng)元來(lái)源的HT22細(xì)胞系,通過(guò)蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中Bi P、p-IRE1等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑標(biāo)記蛋白caspase-12水平的變化,再利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)處理后細(xì)胞凋亡率。第二部分是將3周齡大鼠暴露于七氟醚,通過(guò)蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)Bi P、p-PERK等蛋白及caspase-12在海馬組織中的表達(dá)水平,再運(yùn)用TUNEL染色法觀察其海馬腦片中凋亡細(xì)胞的分布,并利用免疫組織化學(xué)熒光雙標(biāo)法檢測(cè)凋亡細(xì)胞的性質(zhì)。之后取七氟醚暴露后的大鼠海馬腦片利用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)元的內(nèi)在興奮性變化,并在原代培養(yǎng)的大鼠海馬細(xì)胞中做鈣離子探針標(biāo)記,觀察細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化。第三部分是在大鼠麻醉前給予腹腔注射4-PBA抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,待5周后其生長(zhǎng)到成年期做水迷宮測(cè)試,觀察抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)大鼠認(rèn)知能力的保護(hù)作用。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一:七氟醚暴露引起HT22細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究(1)將細(xì)胞分為3組,對(duì)照組、處理組以及加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA組,在麻醉誘導(dǎo)箱中以2 vol%七氟醚處理5小時(shí)后收集細(xì)胞蛋白進(jìn)行蛋白免疫印記檢測(cè)。結(jié)果顯示,處理組細(xì)胞中Bi P、p-IRE1以及活化的caspase-12水平比其余兩組均有顯著升高。4-PBA能顯著降低七氟醚引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平,Р0.01。(2)各組細(xì)胞進(jìn)行七氟醚處理后立即收集細(xì)胞,利用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。結(jié)果顯示,處理組的細(xì)胞凋亡率可高達(dá)9.4±0.13%,比對(duì)照組的1.52±0.60%顯著增高,而加4-PBA組凋亡率為3.93±0.42%。這證明抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可有效減少七氟醚引起的海馬細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)二:七氟醚對(duì)幼年大鼠海馬不同亞區(qū)的影響(1)將三周齡的幼年SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、處理組以及加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA組。在麻醉誘導(dǎo)箱中以2 vol%七氟醚處理5小時(shí)并復(fù)蘇2小時(shí)后收取大腦海馬組織蛋白樣品以及灌注切腦片。海馬組織蛋白樣品進(jìn)行蛋白免疫印記檢測(cè)。結(jié)果顯示,處理組樣品中Bi P、p-PERK以及活化的caspase-12水平比對(duì)照組有顯著升高,而加4-PBA后,這幾個(gè)蛋白水平均有所下降Р0.01。(2)各組大鼠海馬腦片進(jìn)行TUNEL染色,發(fā)現(xiàn)處理組有明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,而且凋亡細(xì)胞主要集中在齒狀回區(qū),CA1-CA3區(qū)幾乎無(wú)細(xì)胞凋亡,加4-PBA組的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯低于處理組。(3)各組大鼠海馬腦片進(jìn)行活化的caspase-12與Neu N免疫熒光雙標(biāo)染色,結(jié)果顯示二者基本重合,且活化的caspase-12的表達(dá)變化與蛋白免疫印記結(jié)果相一致,證明七氟醚處理后主要是神經(jīng)元發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,而非膠質(zhì)細(xì)胞。(4)各組大鼠海馬腦片進(jìn)行TUNEL與Ki67免疫熒光雙標(biāo),結(jié)果顯示齒狀回區(qū)的凋亡細(xì)胞中有部分與Ki67陽(yáng)性細(xì)胞相重合,證明七氟醚誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞中有部分未分化成熟的神經(jīng)干細(xì)胞。(5)3周齡大鼠如上述分組并處理后取新鮮海馬腦片進(jìn)行膜片鉗電生理記錄,檢測(cè)海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的內(nèi)在興奮性。結(jié)果顯示處理組中CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的平均放電個(gè)數(shù)和放點(diǎn)頻率均顯著降低,加4-PBA組這些數(shù)據(jù)卻明顯回升。證明七氟醚使海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的內(nèi)在興奮性顯著降低了。(6)原代培養(yǎng)除齒狀回以外的海馬神經(jīng)元,培養(yǎng)一周后如上述進(jìn)行七氟醚處理,然后在無(wú)鈣緩沖液中做Fluo-3鈣離子探針染色,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),處理組海馬神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度明顯高于對(duì)照組和加4-PBA組P0.01。實(shí)驗(yàn)三:幼年期的七氟醚暴露對(duì)大鼠成年后認(rèn)知能力的影響(1)3周齡SD大鼠如上述隨機(jī)分組并處理,將其正常飼養(yǎng)至2月齡,進(jìn)行水迷宮空間記憶能力測(cè)試,訓(xùn)練四天,結(jié)果在四天的訓(xùn)練過(guò)程中,各組大鼠找到逃生平臺(tái)的時(shí)間均逐漸減少。而從第三天開(kāi)始,處理組大鼠的逃脫時(shí)間明顯長(zhǎng)于其余兩組。(2)訓(xùn)練4天后,第五天進(jìn)行水迷空間探索實(shí)驗(yàn),結(jié)果無(wú)論是在目標(biāo)象限停留時(shí)間還是穿越平臺(tái)區(qū)的次數(shù),處理組均低于其余兩組。加4-PBA組與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)證明了七氟醚能夠通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)海馬神經(jīng)元造成毒性損傷,其創(chuàng)新點(diǎn)在于發(fā)現(xiàn)這種損傷作用在海馬不同亞區(qū)所引起的結(jié)果是不同的,而且如在七氟醚麻醉前給予4-PBA抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可有效降低這種損傷作用并緩解其造成的成年后認(rèn)知能力受損。這進(jìn)一步闡明了七氟醚神經(jīng)毒性的重要機(jī)制,并對(duì)臨床防治這一副作用起到了指導(dǎo)作用。(1)離體和在體實(shí)驗(yàn)均證明七氟醚可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。(2)七氟醚通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激造成海馬齒狀回發(fā)生細(xì)胞凋亡,而在CA1-CA3卻無(wú)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。(3)七氟醚暴露引起海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元內(nèi)在興奮性的降低,這一作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣耗竭和胞漿內(nèi)鈣超載相關(guān)。(4)幼年期七氟醚暴露可引起成年后認(rèn)知能力的缺陷,而這一缺陷可被七氟醚暴露前內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑處理所緩解。
【關(guān)鍵詞】：七氟醚 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 神經(jīng)毒性 凋亡 內(nèi)在興奮性 認(rèn)知能力
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R726.1
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 前言15-17
• 文獻(xiàn)回顧17-25
• 第一部分 七氟醚暴露引起HT22細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究25-34
• 1 材料25-26
• 2 方法26-29
• 3 結(jié)果29-32
• 4 討論32-34
• 第二部分 七氟醚暴露對(duì)幼年大鼠海馬各亞區(qū)的影響34-55
• 1 材料34-36
• 2 方法36-42
• 3 結(jié)果42-53
• 4 討論53-55
• 第三部分 幼年期七氟醚暴露對(duì)大鼠成年后認(rèn)知能力的影響55-61
• 1 材料55
• 2 方法55-56
• 3 結(jié)果56-59
• 4 討論59-61
• 小結(jié)61-62
• 參考文獻(xiàn)62-75
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果75-76
• 致謝76-77

【相似文獻(xiàn)】

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8 曹t熎

本文編號(hào)：258470