本文關(guān)鍵詞：L161982對大鼠實驗性自身免疫性神經(jīng)炎中巨噬細胞亞型變化的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：1.研究目的：吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barre syndrome, GBS)是以周圍神經(jīng)組織脫髓鞘病變及炎性細胞浸潤為病理特點的自身免疫性周圍神經(jīng)性疾病,臨床表現(xiàn)為急性對稱性弛緩性肢體癱瘓。實驗性自身免疫性神經(jīng)炎(experimental allergic neuritis, EAN)是T細胞介導(dǎo)的周圍神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性脫髓鞘疾病,因其與GBS具有相似的臨床及病理特點而成為研究人類GBS的經(jīng)典動物模型。在EAN的發(fā)病過程中,巨噬細胞作為一種經(jīng)典的免疫細胞,參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。近年來研究表明,巨噬細胞在EAN病理過程中主要表現(xiàn)為兩種亞型：經(jīng)典活化的M1亞型巨噬細胞及選擇性活化的M2亞型巨噬細胞。M1型巨噬細胞具有促進炎癥進展及較強的吞噬作用,而M2型巨噬細胞具有抑制炎癥,促進組織重塑和修復(fù)作用。巨噬細胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化的機制仍未十分明確。前列腺素(PG)作為疾病炎癥過程中的非細胞介質(zhì)參與EAN炎癥的發(fā)生發(fā)展。尤其以前列腺素E2與前列腺素EP2及EP4受體相互作用的促炎性作用更為突出。已有研究證實,使用PGE2-EP4受體拮抗劑L161982可以促進包括EAE在內(nèi)的自身免疫疾病的炎癥恢復(fù),減輕臨床癥狀。本研究通過建立EAN大鼠模型,使用前列腺素E2-EP4受體拮抗劑L161982對EAN不同發(fā)病階段進行干預(yù),觀察巨噬細胞M1及M2亞型在EAN不同發(fā)病階段的比例變化及其相關(guān)細胞因子的表達變化,探討PGE2-EP4信號通路對M1與M2亞型轉(zhuǎn)化的影響,進一步探索促進EAN自發(fā)性恢復(fù)的機制。2.研究方法：2.1抗原制備采用高速離心法自新鮮的牛神經(jīng)根提取周圍神經(jīng)髓磷脂(bovine peripheral nerve myelin, BPM)。將提取的BPM溶于含H37Ra熱滅活結(jié)核菌的不完全弗氏佐劑中,邊震蕩混勻邊加入等量生理鹽水制成混懸液。其中,每100ul抗原乳劑含BPM5mg,結(jié)核桿菌lmg。2.2實驗動物處理2.2.1建立EAN模型21只健康、清潔的6-8周(160-170g)齡雌性Lewis大鼠于SPF級實驗室中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。10%水合氯醛(0.3g/kg)麻醉大鼠,于大鼠雙后足墊皮下注射制備好的抗原乳劑(每只200u1),制備EAN動物模型。2.2.2實驗動物分組及藥物干預(yù)將21只EAN大鼠隨機分為A、B、C三組,其中將A組設(shè)為空白對照組。A組大鼠每日腹腔注射L161982溶媒(5mg/kg),B組大鼠自免疫前1天～免疫第8天(免疫階段)每日腹腔注射L161982(5mg/kg)、C組大鼠自免疫第5～16天(發(fā)病期)每日腹腔注射L161982(5mg/kg)。2.3臨床評分自免疫前1天開始每日對3組大鼠進行體重稱量和臨床評分,直至免疫第16天。臨床評分標準如下：①0分：正常;②0.5分：全尾肌張力下降：③1.0分：尾部肌肉癱,松軟拖地;④1.5分：輕度后肢無力或肌張力降低;⑤2.0分：重度后肢無力或輕度后肢癱;⑥2.5分：中度后肢癱;⑦3.0分：嚴重后肢癱;⑧4.0分：嚴重四肢癱。2.4大鼠腹腔巨噬細胞提取于免疫第16天(發(fā)病高峰期)處死3組大鼠,于無菌實驗臺上,向大鼠腹腔注射10mlDMEM,靜置5min后,打開大鼠腹腔,待腸管變扁時,用2ml無菌一次性吸管吸取腹腔灌洗液,置于離心管中。于離心機上離心后,去上清,留沉淀,制備單細胞懸液。對細胞進行計數(shù),按照將細胞按2×106個/mL的密度接種于6孔板中,置于37℃,5%C02培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24h后換液,去掉未貼壁細胞,繼續(xù)培養(yǎng)至第3天。2.5流式細胞術(shù)檢測EAN大鼠腹腔巨噬細胞亞型比例3組大鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)3天后,取6支流式管(編號為1、2、3、4、5、6),試管1～5每管中加入106個/mL巨噬細胞。試管6為空白對照。用PE標記的CD86抗體、Alexa Flour647標記的CD163抗體及抗兔CD68抗體及FITC標記熒光二抗等不同熒光抗體組合分別標記M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞及總巨噬細胞。試管1加入PE標記的CD86抗體,試管2加入Alexa Flour647標記的CD163抗體,試管3加入抗兔CD68抗體及FITC標記熒光二抗,試管4加入PE標記的CD86抗體、抗兔CD68抗體及FITC標記熒光二抗,試管5加入Alexa Flour647標記的CD163抗體、抗兔CD68抗體及FITC標記熒光二抗。試管6為空白對照。充分混勻后,置于室溫暗處孵育30min后,各管加入2mLBSA進行洗滌,1500r/min離心5min后,棄上清。每管加入400 μ LPBS重懸,經(jīng)細胞篩網(wǎng)過濾后,加入1%的多聚甲醛100μL固定,待上機檢測。用流式細胞術(shù)檢測3組大鼠兩種巨噬細胞亞群比例。2.6 ELISA檢測EAN大鼠脾單個核細胞培養(yǎng)上清細胞因子3組EAN大鼠脫頸處死后,無菌條件下摘取EAN大鼠脾臟,置于含5mlDMEM培養(yǎng)基的離心管中,將脾臟置于無菌實驗臺上剪碎后于細胞篩上研磨脾臟碎片,收集脾單個核細胞研磨液。置于離心管中,1200 rpm/min,離心5 min后棄上清并混勻。每管加入2 ml紅細胞裂解液,于室溫下靜置5min后,待細胞懸液變?yōu)闊o色后,每管加入1ml胎牛血清終止破紅。1200 rpm/min,離心5 min后棄上清,加入2mlDMEM培養(yǎng)基并混勻。充分混勻后用細胞計數(shù)板對細胞進行計數(shù)。將細胞按2×106個/mL的密度接種于6孔板中,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)3天后,收集六孔板中細胞培養(yǎng)上清,置于2ml離心管中,3組大鼠單個核細胞培養(yǎng)3天后,取各組大鼠脾單個核細胞培養(yǎng)上清,用ELISA法檢測3組大鼠脾單個核細胞培養(yǎng)上清液中IL-12及IL-10的含量。2.7統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS19.0軟件,應(yīng)用單因素方差分析(one—factor analysis of variance, ANOVA)比較3組間差異,兩兩比較采用LSD法,結(jié)果以均值±標準差(standard deviatio, SD)表示,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3.結(jié)果：3.1各組大鼠的發(fā)病情況和臨床評分自免疫后第6天至第15天,各組大鼠均發(fā)生EAN癥狀。與A組比較,B組、C組發(fā)病時間均明顯延遲(P0.05),B組大鼠發(fā)病時間較C組明顯延遲(P0.05)；與A組比較,B組、C組發(fā)病高峰期臨床評分明顯降低(P0.05);與C組比較,B組大鼠臨床評分降低明顯(P0.05)。3.2流式細胞術(shù)檢測3組大鼠巨噬細胞亞群比例A組相比,使用L161982治療的B組、C組中,CD86+細胞占腹腔灌洗細胞的百分比明顯降低(P0.05),CD86+細胞占CD68+細胞的百分比明顯降低,CD163+細胞占CD68+細胞的百分比明顯升高(P0.05)；與C組比較,B組中CD86+細胞占腹腔灌洗細胞的百分比降低更明顯(P0.05),CD86+細胞占CD68+細胞的百分比降低更明顯(P0.05),CD163+細胞占CD68+細胞的百分比升高更明顯(P0.05)。3.3 ELISA法檢測3組大鼠脾單核細胞培養(yǎng)上清IL-12、IL-10的含量與A組相比,使用L161982治療的B組、C組中,脾單核細胞培養(yǎng)上清中IL-12表達量明顯降低(P0.05),與C組相比,B組中IL-12的含量降低更明顯(P0.05)；與A組相比,B組、C組中IL-10的表達量明顯升高(P0.05),與C組相比,B組中IL-10的表達量升高更明顯(P0.05)。4.結(jié)論：4.1 L161982降低了EAN大鼠中M1型巨噬細胞占總巨噬細胞的比例,升高了M2型巨噬細胞占總巨噬細胞的比例,免疫階段作用更明顯。4.2 L161982抑制了Ml型巨噬細胞相關(guān)細胞因子IL-12的表達,促進了M2型巨噬細胞相關(guān)細胞因子IL-10的表達,免疫階段作用更明顯。4.3 L161982降低了EAN大鼠臨床評分,延遲了EAN大鼠發(fā)病時間,免疫階段作用更明顯。
【關(guān)鍵詞】：L161982 實驗性自身免疫性神經(jīng)炎 巨噬細胞 細胞因子
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R745.43
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-15
• 符號說明15-16
• 前言16-18
• 材料與方法18-24
• 結(jié)果24-26
• 討論26-30
• 結(jié)論30-31
• 參考文獻31-34
• 綜述34-43
• 參考文獻40-43
• 致謝43-44
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文44-45
• 附件45

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