【摘要】：研究背景：:乳腺癌是女性最高發(fā)的惡性腫瘤之一，全球每年約新增138萬(wàn)名乳腺癌患者，占女性新發(fā)腫瘤的30%。并且近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的發(fā)病有年輕化的趨勢(shì)。并已成為威脅女性生命的“頭號(hào)殺手”。乳腺癌是一種全身性疾病，早期手術(shù)是最主要的治療方法，而化療和放療是晚期患者治療的重要策略。腫瘤細(xì)胞的化療耐藥或放療抵抗是乳腺癌臨床治療的主要障礙，而腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者治療失敗和引起癌癥病人生活質(zhì)量下降及死亡的主要原因。目前研究認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞是腫瘤不斷生長(zhǎng)及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源,腫瘤微環(huán)境在調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的自我更新、多向分化及耐藥等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。深入研究腫瘤微環(huán)境中的信號(hào)分子及其傳導(dǎo)通路對(duì)腫瘤干細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，可為制定新的治療策略有效靶向腫瘤干細(xì)胞，減少腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。近年來(lái)，一種促炎細(xì)胞因子，CXC趨化因子8（CXCL8，又名白細(xì)胞介素8，interleukin8，IL-8），在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用引起了研究者的高度關(guān)注。 目的：了解乳腺癌干細(xì)胞IL-8及其受體特別是IL-8受體1（CXCR1）的表達(dá)情況；進(jìn)一步探索外源性高表達(dá)IL-8對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制，為乳腺癌的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：首先，利用磁珠分選出乳腺癌MCF-7細(xì)胞中CD44+/CD24-和非CD44+/CD24-兩組細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR、ELISA或Western Blot法檢測(cè)IL-8及其受體CXCR1的表達(dá)情況。然后，利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建高表達(dá)IL-8的真核表達(dá)載體（pcDNA3.1/myc-HisC-IL-8重組質(zhì)粒）；利用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)到MCF-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24h收集細(xì)胞及其培養(yǎng)上清，qRT-PCR和ELISA方法檢測(cè)IL-8在MCF-7細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)，Western Blot檢測(cè)IL-8受體CXCR1表達(dá)的變化。進(jìn)一步利用CCK-8實(shí)驗(yàn)、Transwell體外侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)了解IL-8高表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響。最后，通過(guò)成球?qū)嶒?yàn)了解MCF-7細(xì)胞高表達(dá)IL-8后乳腺癌細(xì)胞乳腺球形成能力的變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD44+/CD24-和非CD44+/CD24-兩組細(xì)胞所占比例的變化Western Blot檢測(cè)乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物如ALDH1、BMI1表達(dá)的變化；同時(shí)，將高表達(dá)IL-8的MCF-7細(xì)胞接種裸鼠，觀(guān)察裸鼠腫瘤生長(zhǎng)情況；接種后第21天,麻醉后取裸鼠外周血,ELISA法檢測(cè)IL-8水平的變化，取荷瘤裸鼠腫瘤組織，Western Blot檢測(cè)腫瘤組織中IL-8受體CXCR1、ALDH1及BMI1表達(dá)的變化,免疫組織化學(xué)檢測(cè)ALDH1表達(dá)的變化。 結(jié)果： 1．利用磁珠從乳腺癌MCF-7細(xì)胞中分選出CD44+/CD24-和非CD44+/CD24-兩群細(xì)胞后，ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD44+/CD24-細(xì)胞分泌的IL-8量明顯高于非CD44+/CD24-細(xì)胞，而qRT-PCR結(jié)果顯示在mRNA水平上CD44+/CD24-細(xì)胞的IL-8的表達(dá)低于非CD44+/CD24-細(xì)胞。qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)證實(shí)在mRNA和蛋白水平上CD44+/CD24-細(xì)胞IL-8受體CXCR1的表達(dá)顯著高于非CD44+/CD24-細(xì)胞。 2．利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建高表達(dá)IL-8的真核表達(dá)載體（pcDNA3.1/myc-HisC-IL-8重組質(zhì)粒），并用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞中，并用qRT-PCR和ELISA法證實(shí)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞IL-8mRNA和蛋白表達(dá)均升高。進(jìn)一步通過(guò)WesternBlot證實(shí)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞IL-8受體CXCR1的表達(dá)也增加。 3．pcDNA3.1/myc-HisC-IL-8重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后，CCK8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)外源性高表達(dá)IL-8對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖能力沒(méi)有明顯影響；在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中穿過(guò)基質(zhì)膠的MCF-7細(xì)胞數(shù)分別為：IL-8轉(zhuǎn)染組：（247.3±17.6）個(gè)/高倍鏡視野，無(wú)關(guān)序列組：（76.7±3.1）個(gè)/高倍鏡視野,空白對(duì)照組：（86.3±7.4）個(gè)/高倍鏡視野；在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中穿過(guò)小室基底膜的細(xì)胞數(shù)分別為：IL-8轉(zhuǎn)染組：（255.3±22.7）個(gè)/高倍鏡視野,無(wú)關(guān)序列組：（105.3±7.1）個(gè)/高倍鏡視野，空白對(duì)照組：（126.7±11.6）個(gè)/高倍鏡視野，提示，高表達(dá)IL-8的乳腺癌MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著高于轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列或空白對(duì)照的MCF-7細(xì)胞，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05）。 4．高表達(dá)IL-8的乳腺癌MCF-7細(xì)胞形成乳腺球的體積、乳腺球的數(shù)量明顯高于空白對(duì)照組和無(wú)關(guān)序列組；流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高表達(dá)IL-8的乳腺癌MCF-7細(xì)胞中CD44+/CD24-比例為16.39%±0.56%，明顯高于空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列組的MCF-7細(xì)胞,其CD44+/CD24-的細(xì)胞比例分別為6.39%±0.59%，5.28%±1.1%；WesternBlot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高表達(dá)IL-8的乳腺癌MCF-7細(xì)胞乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1及BMI1的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列組細(xì)胞，提示高表達(dá)IL-8不但可上調(diào)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的干細(xì)胞數(shù)量而且還能增強(qiáng)其“干性”標(biāo)志物。進(jìn)一步體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)：裸鼠接種等數(shù)量的轉(zhuǎn)染IL-8或轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列的MCF-7細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染IL-8的荷瘤裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)速度明顯快于轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列的荷瘤裸鼠。接種后第21天，轉(zhuǎn)染IL-8的荷瘤裸鼠外周血中IL-8水平顯著高于轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列的荷瘤裸鼠，同時(shí)，轉(zhuǎn)染IL-8荷瘤裸鼠的瘤重為（4.93±0.3）g，顯著高于轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列荷瘤裸鼠的瘤重（2.28±0.39）g，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；Western Blot檢測(cè)證實(shí)轉(zhuǎn)染IL-8后荷瘤裸鼠腫瘤組織中IL-8受體CXCR1的表達(dá)顯著高于轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列的荷瘤裸鼠；免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染IL-8的荷瘤裸鼠腫瘤組織ALDH1的表達(dá)明顯高于轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列的荷瘤裸鼠，且Western Blot證實(shí)轉(zhuǎn)染IL-8后荷瘤裸鼠腫瘤組織IL-8受體CXCR1及乳腺癌干細(xì)胞的相關(guān)蛋白ALDH1及BMI1顯著高于轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列的荷瘤裸鼠。 結(jié)論： 1．乳腺癌CD44+/CD24-干細(xì)胞可分泌IL-8并表達(dá)IL-8受體CXCR1。 2．外源性高表達(dá)IL-8在乳腺癌細(xì)胞IL-8受體CXCR1的表達(dá)水平也增高，伴有乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的增強(qiáng)，同時(shí)乳腺癌細(xì)胞中CD44+/CD24-干細(xì)胞的數(shù)量、成球能力及干細(xì)胞相關(guān)蛋白ALDH1及BMI1的表達(dá)亦顯著增高，明顯促進(jìn)荷瘤裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R737.9

【共引文獻(xiàn)】

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1 巨大維;白細(xì)胞介素8在胃癌細(xì)胞侵襲中的作用及消痰散結(jié)方的干預(yù)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

2 王玲;Celecoxib通過(guò)NF-κB通路調(diào)控人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生物活性的實(shí)驗(yàn)研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2010年

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1 劉為青;乳腺癌基因治療特異性多肽載體的研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2008年

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本文編號(hào)：2577597