【摘要】：研究背景 生長激素(growth hormone,GH)是人體的重要激素,在機體的生長、發(fā)育、代謝和衰老等過程起著重要的作用。隨著80年代生物工程技術(shù)的進步,重組人生長激素(recombinant human growth hormone,rhGH)合成成功。從而,生長激素的臨床應(yīng)用逐漸普及,從最初的僅用于治療兒童生長激素缺乏癥(growth hormone deficiency,GHD),擴展到特發(fā)性矮小(idiopathic short stature,ISS)、宮內(nèi)生長遲緩、先天性卵巢發(fā)育不全綜合征(Turner syndrome,TS)、嚴重燒傷、膿毒癥、急性重癥胰腺炎、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)、慢性腎臟病等。 然而,隨著重組人生長激素的廣泛應(yīng)用,其安全性問題越來越受到廣泛關(guān)注。其短期治療少有不良反應(yīng),而長期應(yīng)用則會出現(xiàn)各種負面效應(yīng),例如胰島素抵抗(insulin resistance,IR)、腫瘤等。 研究顯示胰島素抵抗與多種代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),如糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)、肥胖、非酒精性脂肪肝、高血壓等。近來還有研究發(fā)現(xiàn),胰島素抵抗與多種消化系腫瘤如肝癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等也存在密切關(guān)系。 胰島素信號是機體代謝調(diào)節(jié)的重要信號,主要包括MAPK/ERK和PI3K/Akt兩條通路,前者主要涉及細胞生長和增殖,實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；后者則與多種代謝調(diào)控有關(guān)。P13K由兩個亞基組成,一個是調(diào)節(jié)亞基p85,一個是催化亞基p110。PI3K/Akt通路可被多種細胞因子激活,如在SPC-A1細胞中表皮生長因子(epidermal growth hormone,EGF)可使PI3K/Akt通路激活。正常情況下,胰島素與受體(insulin receptor,IR)結(jié)合,引起自身磷酸化,激活胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate,IRS-1),酪氨酸殘基磷酸化的IRS-1與p85亞基結(jié)合,進而激活p110亞基,活化的PI3K使磷脂酰肌醇4,5二磷酸(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate,PI(4,5)P2)轉(zhuǎn)化成磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸(PI(3,4,5)P3)。PIP3使Akt/PKB發(fā)生變構(gòu)從而被激活�；罨腁kt通過各種下游信號調(diào)控細胞代謝、增殖、分化與凋亡。因此,上述信號通路中的任一環(huán)節(jié)受到抑制或者被阻斷都可導(dǎo)致宏觀上葡萄糖轉(zhuǎn)運受阻即胰島素抵抗。 肝臟是生長激素最重要的靶器官,生長激素參與的通路主要包括JAK2/STAT5、MAPK/ERK和PI3K/Akt通路。有研究報道,生長激素可以對胰島素PI3K/Akt通路有不同效應(yīng)的作用,并能誘導(dǎo)胰島素抵抗。雖然,有關(guān)研究已有不同的報道,然而,這些研究并沒有明確地研究生長激素對胰島素信號的時間效應(yīng)關(guān)系,更沒有對這種時間效應(yīng)進行動物水平和細胞水平的比較研究。因此,為了更好地了解其機制,本課題同時比較在動物水平和細胞水平上,生長激素對胰島素信號作用的時間效應(yīng)。有報道稱生長激素和胰島素能共享PI3K/Akt通路,那么生長激素誘導(dǎo)肝臟的胰島素抵抗是否與內(nèi)源性胰島素分泌有關(guān),是否是兩者相互作用共同導(dǎo)致的,也是本課題所要探討的問題。 第一部分不同時間點生長激素對肝臟胰島素信號的影響 [目的] 本部分內(nèi)容在細胞培養(yǎng)水平和動物模型上,研究生長激素作用不同時間情況下對肝臟胰島素信號的效應(yīng)。 [方法] 1.細胞試驗：本課題選擇人肝癌細胞HepG2。培養(yǎng)液為DMEM(含10%胎牛血清)。細胞血清饑餓12小時后,再用生長激素(2μg/ml)分別刺激4小時和30分鐘,裂解前都行10分鐘的胰島素(0.15IU/ml)刺激,RIPA裂解液裂解細胞,提取蛋白。 2.動物試驗：6-8周齡Balb/c雄性小鼠48只隨機分成6組：3w rhGH組、3w control組、4h rhGH組、4h control組、30min rhGH組、30min control,每組8只。重組人生長激素腹腔注射濃度為1μg/g體重,對照注射等體積無菌生理鹽水。小鼠處死前10分鐘或腹腔注射胰島素(recombinant human insulin,rhINS)(2IU/kg體重),或?qū)φ兆⑸涞润w積無菌生理鹽水。戊巴比妥鈉充分麻醉處死小鼠,摘取肝臟,液氮速凍后,-80℃冰箱存放備檢。 3.蛋白信號分子的測定肝組織冰上研磨,RIPA裂解液裂解,提取蛋白。與HepG2細胞蛋白一起用免疫印跡法(western blot,WB)檢測Akt磷酸化水平。 4.統(tǒng)計分析采用SPSS13.0軟件和Excel2003分析。實驗數(shù)據(jù)以“算術(shù)平均值±標準差(arithmetic mean±standard deviation,M±SD)’表示。兩組間方差齊性采用兩獨立樣本t檢驗(Independent-Samples T Test),方差不齊則采用Satterthwaite近似t檢驗。各組間比較采用方差分析(One-Way ANOVA),方差齊性的多重比較采用Bonferroni檢驗,方差不齊采用Dunnett'T檢驗。P值0.05定義為有顯著差異,有統(tǒng)計學(xué)意義。 [結(jié)果] 1.體外研究(細胞培養(yǎng)試驗)中不同時間點生長激素刺激的效應(yīng)：檢測結(jié)果顯示,胰島素刺激后,與對照組(灰度值：1.327±0.089)相比,30min rhGH刺激使HepG2細胞p-Akt水平(1.463±0.031)略有增加,但差異不明顯(p=0.104)；而4h rhGH刺激則使HepG2細胞p-Akt水平(0.929±0.048)顯著降低(p=0.001)。 2.體內(nèi)研究不同時間點生長激素的效應(yīng)： A)小鼠處死前10分鐘,注射外源胰島素,以檢測肝臟Akt磷酸化變化。western blot結(jié)果顯示：30min rhGH組、4h rhGH組小鼠肝臟p-Akt信號與各自對照組相比(30min組：1.046±0.0892vs1.103±0.170；p=0.411；4h組：1.035±0.085vs1.134±0.147；p=0.121),均無明顯變化；而3w rhGH處理的小鼠,其肝臟p-Akt水平(0.494±0.206)與其對照組(1.046±0.329)相比顯著降低(p=0.001)。 B)小鼠處死前,無外源胰島素的注射,以檢測小鼠內(nèi)源性胰島素信號激活的Akt磷酸化變化。western blot結(jié)果顯示：30min rhGH組(1.108±0.332)小鼠肝臟p-Akt信號較對照組(0.218±0.055)顯著增強(p=0.000);4h rhGH組(0.803±0.179)與4h control組(0.701±0.052)相比,小鼠肝臟p-Akt信號無明顯變化(p=0.14)；而3w rhGH組(0.949±0.445)小鼠肝臟p-Akt信號較其對照組(1.950±0.552)顯著減弱(p=0.000)。 [結(jié)論] 1.在細胞培養(yǎng)水平,短時生長激素刺激能促進胰島素信號激活,而長期刺激則能抑制胰島素信號； 2.在健康小鼠模型中,短時生長激素刺激能促進基礎(chǔ)的p-Akt信號的激活,隨著時間延長逐漸變化成抑制效應(yīng); 3.在健康小鼠模型中,短時生長激素刺激對外源胰島素刺激下的p-Akt激活沒有明顯影響,但長期刺激則能抑制胰島素p-Akt信號。 4.生長激素對肝臟胰島素信號的變化進程在體內(nèi)水平(In vivo)比細胞水平(In vitro)的慢,首次揭示了以前報道的體內(nèi)環(huán)境中生長激素刺激對胰島素的效應(yīng)可能不僅是兩激素間的作用,而是眾多激素共同作用的效果。 第二部分長期生長激素誘導(dǎo)健康及1型糖尿病小鼠肝內(nèi)胰島素抵抗 [目的] 前述實驗發(fā)現(xiàn)在細胞及動物水平,生長激素刺激隨時間延長均能抑制胰島素PI3K/Akt信號。然而,長期生長激素刺激可以誘導(dǎo)肝內(nèi)胰島素抵抗,是否與自身胰島素分泌有關(guān)?如果破壞了小鼠的胰島素,長期生長激素是否仍然可以誘導(dǎo)胰島素抵抗? [方法] 1.鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)建立1型糖尿病小鼠模型6-8周齡Balb/c雄性小鼠禁食8小時后稱重并測量空腹血糖。連續(xù)3天予腹腔注射STZ(120g/kg體重)。3天后測量空腹血糖、體重,空腹血糖≥11.1mmol/L認為1型DM造模成功進入下一步實驗。 2.成模小鼠隨機分為STZ+rhGH組和STZ+control組,STZ+rhGH組同前述3w rhGH組,每天予腹腔注射rhGH(1μg/g體重),STZ+control組同3w control組予等體積無菌生理鹽水,連續(xù)3周。4組小鼠注射完最后1次生長激素和生理鹽水后禁食8小時測量體重及空腹血糖。次日7：00處死,處死前10分鐘每組隨機抽取一半小鼠予腹腔注射重組人胰島素(recombinant human insulin,rhINS)(2IU/kg體重),另一半小鼠注射等體積無菌生理鹽水對照。心臟采血備ELISA試劑盒檢測小鼠血漿胰島素濃度。采血后快速摘取肝臟組織液氮速凍,-80℃冰箱保存。 3.人肝癌細胞HepG2種植于細胞培養(yǎng)板,含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),血清饑餓12小時后,按照實驗方案給rhGH(2ug/ml)和胰島素(0.15IU/ml)刺激,RIPA裂解液裂解收集細胞提取蛋白。 4.蛋白信號分子的測定肝組織研磨,RIPA裂解液裂解,提取蛋白o western blot檢測Akt磷酸化水平。 5.統(tǒng)計分析分析方法同上。 [結(jié)果] 1.連續(xù)注射STZ3天后,其中19只小鼠的血糖≥11.1mmol/L,隨機抽取16只進入下一步實驗。 2.連續(xù)注射3周重組人生長激素后,3w rhGH組和3w control組小鼠體重均有增加,但3w rhGH組小鼠體重增加幅度較其對照組(6.850g±1.303g vs3.800g±0.660g,p=0.001)顯著增加；而STZ+rhGH組和STZ+control組小鼠體重均有明顯下降,但STZ+rhGH組體重減輕幅度顯著低于STZ+control組(1.686g±1.111g vs3.878g±1.810g,p=0.008). 3.胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=[空腹胰島素(mU/L)×空腹血糖(mmol/L)]/22.5.連續(xù)3周重組人生長激素注射后,3w rhGH組、STZ+rhGH組分別和各自對照組比較,血糖變化無顯著差異(3w組：4.483m mol/L±0.331m mol/L vs4.417m mol/L±0.319m mol/L,p=0.73;STZ組：18.500m mol/L±3.390m mol/L vs20.040mmol/L±5.988m mol/L,p=0.63).血漿ELISA結(jié)果顯示,3w rhGH組小鼠空腹血漿胰島素水平較對照組顯著增加(8.845mU/L±3.542mU/L vs3.158mU/L±2.418mU/L, p=0.009);STZ+rhGH組小鼠空腹血漿胰島素水平較對照組也顯著增加(9.468mU/L±3.559mU/L vs3.719mU/L±2.705mU/L, p=0.021)因而3w rhGH組小鼠和對照組相比,胰島素抵抗指數(shù)顯著升高(1.736±0.635vs0.631±0.496,p=0.007); STZ+rhGH組小鼠和對照組相比,胰島素抵抗指數(shù)顯著升高(7.873±3.784vs3.078±2.413,p=0.044) 4.小鼠Western blot檢測結(jié)果顯示,STZ+rhGH組、3w rhGH組分別和各自對照組相比,無論基礎(chǔ)還是胰島素激發(fā)后,Akt磷酸化水平均有顯著降低(基礎(chǔ)：1.385±0.301vs3.199±0.994,p=0.013；胰島素激發(fā)后：0.470±0.509vs1.002±0.572,p=0.041)。 5.HepG2細胞的western blot檢測結(jié)果顯示,與對照組(灰度值：0.895±0.060)相比,4h rhGH組(0.353±0.053)、4h rhGH+30min insulin組(0.265±0.060)p-Akt信號均顯著下降(p0.001)；但4h rhGH+30min insulin組和4h rhGH組p-Akt信號比較無明顯差異(p=0.462) [結(jié)論] 1.長期生長激素可以誘導(dǎo)健康小鼠胰島素抵抗,也可以誘導(dǎo)1型糖尿病小鼠胰島素抵抗； 2.細胞水平上,30分鐘胰島素模擬內(nèi)源性胰島素分泌,無論有無內(nèi)源胰島素刺激,生長激素均能抑制胰島素信號,說明生長激素誘導(dǎo)胰島素抵抗與內(nèi)源性胰島素無關(guān),或各有不同機制。
【圖文】：

圖2-2: 1型糖尿病小鼠3周rhGH注射后STZ+rhGH組和對照組的體重下降幅度比較。條形圖的誤差線表示平均值±標準誤。Figure 1-1: 3 weeks' rhGH decreased weight loss in mice with STZ-induce 1 type DM. Thevalues in bars were displayed as means 士 standard errors.41
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R587.1

【參考文獻】

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本文編號：2569909