【摘要】：目的:1.于整體水平探討不同GRK亞型對心肌Ca MKII活化的影響;篩選出作用顯著的GRK亞型,觀察其在βAR持久興奮誘發(fā)病理性心肌肥厚中的作用。2.探討持久興奮βAR,氧化應激信號分子ROS是否通過影響該GRK亞型激活心肌Ca MKII,誘發(fā)病理性心肌肥厚。方法:本課題分兩部分進行:第一部分:采用雄性小鼠(體重20-28g)作為野生對照組(WT:SPF級C57BL/6小鼠)、GRK2,3,5,6基因敲除小鼠(GRK2KO、GRK3KO、GRK5KO、GRK6KO)和β1、2-AR突變小鼠(GRK(-):β-AR缺乏GRK磷酸化位點)。各組小鼠分別給予異丙基腎上腺素(ISO)刺激或等量生理鹽水兩周,斷頸處死動物,切取左心室并剝離粘連組織,經(jīng)液態(tài)氮處理后貯存于-80°C。Western Blot用于檢測有活性的鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ca MKⅡ(p-Ca MKⅡThr286/T-Ca MKⅡ)的表達變化;心肌勻漿Ca MK II活性采用ELISA方法檢測;HE染色檢測心肌細胞組織學變化。第二部分:采用健康雄性SD大鼠,體重180~200g,隨機分成4組,每組6只:正常對照組(CTRL)、ISO處理組(ISO)、正常NAC組(CTRL+NAC)和ISO處理NAC組(ISO+NAC)。ISO給藥方法是ISO及ISO+NAC組動物每天腹腔注射ISO(3mg/kg/d),CTRL及CTRL+NAC組腹腔注射相同體積的生理鹽水;NAC給藥方法:CTRL+NAC及ISO+NAC組動物每日自由飲用含15g/L NAC的飲用水。連續(xù)給藥14天后,于第二周末麻醉下處死動物。以心重指數(shù)(HW/BW)和左心室組織HE染色檢測心肌肥厚情況;RT-q PCT、免疫組化和Western blot檢測左室心肌GRK5的表達變化。結果 :第一部分:給予ISO刺激后,WT及GRK2KO,GRK3 KO,and GRK 6 KO小鼠心肌組織中有活性的Ca MK II表達水平明顯增加(n=5,P0.05;WT,GRK2KO,GRK3 KO,GRK6 KO ISO刺激組分別與非刺激組相比),而GRK5 KO小鼠心肌組織ISO刺激后有活性Ca MK II表達無明顯增加;GRK(-)小鼠心肌組織中ISO刺激的有活性Ca MK II表達亦無明顯增加。ELISA檢測發(fā)現(xiàn),ISO刺激后WT及GRK2KO,GRK 3 KO,and GRK 6 KO基因敲除小鼠心肌組織勻漿的Ca MK II活性顯著增加(n=5,P0.05;WT,GRK2 KO,GRK3 KO,GRK6 KO ISO刺激組分別與非刺激組相比),而GRK5 KO及GRK(-)小鼠ISO刺激后Ca MKII活性無明顯增加。HE染色發(fā)現(xiàn)ISO刺激可使WT小鼠出現(xiàn)明顯心肌肥厚表現(xiàn),而GRK5 KO小鼠ISO刺激的心肌肥厚得到顯著改善。第二部分:(1)ISO刺激組大鼠心重指數(shù)(HW/BW)明顯高于CTRL組[(3.99±0.13 vs 3.31±0.10)mg/g,P0.05],HE染色顯示ISO刺激組與CTRL組相比,心肌細胞橫截面積明顯增大[(11117.00±387.57 vs 4572.23±176.39)μ3，

本文編號：2544717