【摘要】：研究目的臨床上腦缺血發(fā)生后,缺血半暗帶形成,再灌注會(huì)造成腦組織損傷,其中缺氧和炎癥反應(yīng)尤為突出,臨床上患者出現(xiàn)嚴(yán)重的偏身感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)及情感障礙。本論文探索了改良線栓法在腦血流儀的檢測(cè)下制作大鼠大腦中動(dòng)脈線栓阻塞腦缺血再灌注損傷模型,并探討了針刺百會(huì)、足三里穴對(duì)腦缺血再灌注損傷后大鼠的行為學(xué)、神經(jīng)炎癥缺氧反應(yīng)及神經(jīng)血管再生的干預(yù)機(jī)制,從表觀和分子生物學(xué)角度探索針刺治療缺血性腦血管病的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表法將健康雄性SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組、針刺組、電針組和藥物組。后四組根據(jù)再灌注時(shí)間又分為1d、3d、5d和7d四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn),分批次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以改良線栓法阻塞大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈制備腦缺血再灌注損傷模型,并用腦血流儀檢測(cè)大腦中動(dòng)脈分布區(qū)的血流,在插入線栓后出現(xiàn)70%以上缺血,并維持1.5h后實(shí)現(xiàn)再灌注,即為模型成功。模型組：大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞造成腦缺血1.5h后再灌注；針刺組：腦缺血再灌注后24h給予針刺百會(huì)和左足三里穴；電針組：在針刺組基礎(chǔ)上加用脈沖治療儀；藥物組：每日腹腔注射依達(dá)拉奉。各組大鼠根據(jù)再灌注時(shí)間以Bederson及mNSS分評(píng)估大鼠神經(jīng)功能。再灌注72h后,各組大鼠麻醉后斷頭取腦,TTC染色后以Image J計(jì)算其腦梗死體積。通過(guò)抓力試驗(yàn)、轉(zhuǎn)角試驗(yàn)、圓筒試驗(yàn)、糖水偏愛(ài)試驗(yàn)、曠場(chǎng)試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)大鼠的肢體的肌力、肢體使用偏向、探索能力及情緒改變。應(yīng)用免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry)染色和蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測(cè)腦缺血大鼠VEGF、Hif-1a、Thorase、GFAP的表達(dá)；采用RT-PCR法檢測(cè)腦缺血大鼠VEGF、 Hif-1a、Thorase、GFAP等基因的mRNAs表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. Bederson評(píng)分顯示：假手術(shù)組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分為0,未見(jiàn)任何神經(jīng)功能損傷；而其他各個(gè)造模組在再灌注24h均有相應(yīng)的神經(jīng)損傷,隨著各組的治療,針刺組、電針組和藥物組的神經(jīng)功能評(píng)分低于模型組；針刺組、電針組、藥物組組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 (圖1-6)2.TTC染色顯示：假手術(shù)組大鼠雙側(cè)腦組織結(jié)構(gòu)規(guī)整,層次分明,呈鮮紅色,未見(jiàn)缺血灶；模型組、針刺組、電針組及藥物組在大鼠右側(cè)腦組織大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域,可見(jiàn)到淡白色的梗死灶,邊緣伴有淡紅色,且伴隨72h的治療后三組與鮮紅色的正常腦組織形成對(duì)比。針刺組、電針組和藥物組大鼠腦梗死體積低于模型組；針刺組及電針組大鼠腦梗死體積與藥物組組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 (圖1-7,1-8)3.行為學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)定顯示： (1)mNSS評(píng)分顯示：假手術(shù)組大鼠未見(jiàn)任何神經(jīng)功能損傷、腦組織無(wú)缺血,評(píng)分為0；而其他各個(gè)造模組在再灌注24h均有相應(yīng)的神經(jīng)損傷,治療后,藥物組的神經(jīng)功能評(píng)分在1、3、5、7d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于模型組；電針組在1d和7d明顯低于模型組；針刺組、電針組、藥物組組間相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (圖2-5)(2)抓力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：假手術(shù)組未見(jiàn)任何肌力損傷；模型組、針刺組、電針組及藥物組均存在不同程度的肌力損害；電針組和藥物組在1、3、5、7d各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的肌力均高于模型組；針刺組除了在1d時(shí)與模型組沒(méi)有差異外,其余3、5、7d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)有差異；后三組組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(圖2-6)(3)轉(zhuǎn)角試驗(yàn)顯示：假手術(shù)組未見(jiàn)明顯的肢體使用偏性,側(cè)向指數(shù)趨向于0；針刺組和電針組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的前肢側(cè)向指數(shù)均低于模型組；在3、5、7d,藥物組低于模型組；后三組組間比較統(tǒng)計(jì)無(wú)差異。(圖2-7)(4)圓筒試驗(yàn)顯示：假手術(shù)組無(wú)肢體使用不對(duì)稱(chēng)性;其余各組均存在不同程度的肢體使用偏性及不對(duì)稱(chēng)性,在1、3、5、7d各個(gè)時(shí)間點(diǎn),電針組和藥物組的肢體使用不對(duì)稱(chēng)評(píng)分低于模型組；而針刺組的使用不對(duì)稱(chēng)性僅在在3d與5d低于模型組,后三組組間未見(jiàn)差異。(圖2-8)(5)糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)：假手術(shù)組大鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)糖水偏向指數(shù)均較高；在5d和7d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上,電針組和藥物組的糖水偏愛(ài)指數(shù)均高于模型組；針刺組與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；后三組組間見(jiàn)未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(圖2-9)(6)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)顯示：整體運(yùn)動(dòng)路程及平均速度上,各組之間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在周?chē)鷪?chǎng)和中心場(chǎng),各個(gè)組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的累積停留時(shí)間和頻率均未見(jiàn)明顯差異。 (圖2-10)4.神經(jīng)血管再生相關(guān)指標(biāo)表達(dá)(1)免疫組化結(jié)果顯示：模型組VEGF、Hif-1a、 GFAP及Thorase蛋白整體呈現(xiàn)增高趨勢(shì)。①VEGF蛋白：針刺組、電針組、藥物組隨著時(shí)間進(jìn)程該蛋白呈現(xiàn)出先降低后增高的變化趨勢(shì),蛋白表達(dá)均在7d時(shí)呈現(xiàn)高峰。模型組在1、3、5、7d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯高于假手術(shù)組；針刺組在1d及7d時(shí)間點(diǎn)均高于假手術(shù)組；電針組及藥物組在1、5、7d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于假手術(shù)組；與模型組相比,針刺、電針組在7d明顯增高；針刺組在5d時(shí)間點(diǎn)上低于模型組；各治療組間比較,藥物組高于針刺組、電針組。(圖3-1)②Hif-1a蛋白：模型組蛋白表達(dá)在缺血再灌注1d呈現(xiàn)高峰；模型組、針刺組、電針組、藥物組在1、3、5、7d均明顯高于假手術(shù)組；針刺組與藥物組在1d、3d和7d低于模型組；電針組在1d及7d明顯低于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (圖3-5)③Thorase蛋白：模型組、針刺組、電針組、藥物組均在1d時(shí)明顯高于假手術(shù)組；在5d時(shí),模型組高于假手術(shù)組；藥物組低于假手術(shù)組；針刺組在5d和7d均低于模型組；電針組及藥物組在5d及7d明顯低于模型組,各治療組間未見(jiàn)明顯差異。 (圖3-9)④GFAP蛋白：針刺組在7d高于模型組；電針組在1d和7d明顯高于模型組；藥物組在3d和7d明顯高于模型組；組間比較,藥物組在各時(shí)間點(diǎn)均低于針刺組；藥物組在3d和7d低于電針組。 (圖3-13) (2)Western blot結(jié)果顯示：①VEGF蛋白：與模型組相比,針刺組、電針組、藥物組均呈現(xiàn)不同程度的高表達(dá),針刺組在1、3、7d表達(dá)量高于模型組；電針組在7d時(shí)表達(dá)明顯高于模型組；后三組組間比較無(wú)差異。(圖3-2,3)②Hif-1a蛋白：在3d時(shí),針刺組、電針組明顯低于模型組;后三組組間比較無(wú)差異。(圖3-6,7)③Thorase蛋白：與假手術(shù)組相比,模型組在3d和7d Thorase蛋白明顯高表達(dá)；針刺組和電針組在1d和7d的表達(dá)高于假手術(shù)組；藥物組在1、3、7d高于假手術(shù)組；與模型組相比,針刺組、電針組、藥物組在1d和7d均增高；各治療組比較,藥物組在3d明顯高于針刺組；在5d高于電針組；針刺組和電針組間未見(jiàn)明顯差異。 (圖3-10,11)④GFAP蛋白：與假手術(shù)組相比,模型組在1、3、5、7d均明顯增高；針刺組和電針組在1、3、5、7d均明顯增高；藥物組在1、5、7d明顯增高；各治療組間比較,電針組在5d明顯低于針刺組,在7d高于針刺組,藥物組在3、5、7d均明顯低于針刺組；藥物組在7d明顯低于電針組。(圖3-14,15)(3) RT-PCR結(jié)果顯示：①VEGF mRNA:針刺組、電針組及藥物組的基因表達(dá)逐漸增高,模型組未見(jiàn)明顯變化；其中電針組在3d、5d及7d明顯高于模型組；針刺組及藥物組僅在7d時(shí)高于模型組；各治療組間比較,藥物組在3d明顯高于針刺組。 (圖3-4)②Hif-1a mRNA:針刺組、電針組、藥物組在3d時(shí)的基因表達(dá)呈現(xiàn)高峰；各治療組表達(dá)與模型組未見(jiàn)明顯差異；藥物組僅在7d高于模型組；各治療組間比較,電針組在1d明顯低于針刺組；藥物組在7d明顯高于針刺組、電針組。 (圖3-8)③Thorase mRNA針刺組在1、3、5、7d均低于模型組；電針組和藥物組僅在7d明顯低于模型組。各治療組間比較,電針組及藥物組在1、3、5d明顯高于針刺組。(圖3-12)④GFAP mRNA:在1、3、5、7d,針刺組和藥物組低于模型組；電針組僅在1、3、5d明顯低于模型組；各治療組間相比,僅藥物組在5d明顯低于電針組。 (圖3-16)結(jié)論1.腦缺血再灌注損傷72h后,針刺、電針及藥物治療可以挽救壞死的半暗帶區(qū)域的腦組織。2.大鼠腦缺血再灌注損傷后表現(xiàn)出明顯的偏身感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)障礙及情感障礙,針刺、電針及藥物治療可以有效地改善大鼠的神經(jīng)功能,提高大鼠的肌力及肢體使用偏性,改善大鼠的抑郁情緒。3.大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織中神經(jīng)血管再生因子VEGF、Hif-1a、 Thorase及GFAP表達(dá)均有所上調(diào)。針刺、電針及藥物治療能夠上調(diào)VEGF、GFAP蛋白表達(dá)；下調(diào)Hif-1a、Thorase蛋白的表達(dá)。創(chuàng)新點(diǎn)以經(jīng)典線栓法制備大鼠MCAO模型,并采用激光多普勒血流儀檢測(cè)MCA區(qū)域的腦血流的改變,進(jìn)一步驗(yàn)證模型成功。通過(guò)檢測(cè)大鼠的神經(jīng)功能及行為學(xué),直觀的驗(yàn)證了針刺的有效性；并且采用免疫組化、蛋白印跡、RT-PCR法分別從蛋白及基因水平檢測(cè)腦組織中VEGF、Hif-1a、Thorase、GFAP神經(jīng)血管再生相關(guān)通路上的重要指標(biāo)的表達(dá),驗(yàn)證針刺百會(huì)、足三里穴對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織的相應(yīng)機(jī)制。經(jīng)文獻(xiàn)檢索,尚未發(fā)現(xiàn)針刺百會(huì)和足三里穴同時(shí)對(duì)大鼠行為學(xué)及腦缺血再灌注損傷腦組織中VEGF、Hif-1a、Thorase、GFAP的干預(yù)機(jī)制的研究。
【圖文】：

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本文編號(hào)：2541326