【摘要】：背景 肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快,對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。近20年來許多國家都報道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高,男性肺癌發(fā)病率和死亡率均居所有惡性腫瘤的第一位,女性肺癌發(fā)病率居第二位,死亡率居第一位。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),是最為常見的肺癌,約占肺癌總數(shù)的80-85%,包括鱗癌、腺癌、大細胞癌,與小細胞癌相比其癌細胞生長分裂較慢,擴散轉(zhuǎn)移相對較晚,多通過淋巴、血液及腫瘤浸潤等方式進行局部侵犯和遠處轉(zhuǎn)移。如何切斷腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的途徑是目前控制肺癌進展的重要課題。 恩度(重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液,Recombinant Human Endostatin Injection)是由我國自主研發(fā)的一種抗癌新藥,為內(nèi)源性血管生成抑制劑,能夠選擇性抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖與遷移,達到抑制腫瘤形成新生血管、切斷腫瘤細胞的營養(yǎng)供給途徑、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的目的。恩度對腫瘤血管生成的抑制作用已有較多研究與報道,但其對腫瘤淋巴管的生成是否存在類似的抑制作用,相關的基礎實驗和臨床研究報道仍很少見。為此,我們設計并進行了相關基礎與臨床研究,以期探討恩度對NSCLC淋巴管生成及淋巴轉(zhuǎn)移的作用。 目的 1.通過建立非小細胞肺癌裸鼠荷瘤模型,觀察重組人血管內(nèi)皮抑制素對腫瘤動物模型淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移的抑制作用； 2.免疫組織化學染色法檢測肺癌組織中VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3表達水平,觀察恩度對VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3表達水平情況的影響； 3.采用免疫磁珠富集法負性篩選策略檢測實驗裸鼠外周血循環(huán)腫瘤細胞數(shù)量,對比空白對照組與各實驗組循環(huán)腫瘤細胞數(shù)量的差異； 4.對比非小細胞肺癌術(shù)后單純輔助化療與聯(lián)合恩度進行術(shù)后輔助治療的療效差異,根據(jù)術(shù)后定期復查結(jié)果,分析恩度聯(lián)合化療對于非小細胞肺癌患者術(shù)后一年復發(fā)率的影響； 5.根據(jù)患者術(shù)前與術(shù)后復查的影像學檢查結(jié)果,對比患者全身淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況,評價恩度對患者術(shù)后腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的抑制作用。 方法 1.1從北京協(xié)和醫(yī)科大學基礎實驗室細胞庫購買A549人肺癌細胞株1株,胰蛋白酶-EDTA消化液消化后傳代培養(yǎng),傳至第5代后,A549肺癌細胞數(shù)量達到建立裸鼠肺癌模型要求。 1.2BALB/C裸鼠60只,5周齡,雌雄各半,體重均為22-25g之間,購于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心,裸鼠飼養(yǎng)在解放軍304醫(yī)院SPF級動物實驗室。裸鼠購進后觀察1周,于裸鼠右側(cè)腋窩經(jīng)皮下注射濃度為1×107/m1的A549肺癌細胞0.2m1,建立裸鼠異種移植荷瘤模型。接種腫瘤細胞3周后,選取56只建模成功的荷瘤裸鼠,腫瘤平均直徑為7±0.4mm。 1.356只成瘤裸鼠隨機分為8個小組(n=7),各組間裸鼠體重,腫瘤直徑無顯著性差異,同組雌雄裸鼠分開飼養(yǎng)。包括1個對照組(生理鹽水0.2m1,1次/d),1個順鉑組(順鉑20μg,隔日1次),3個不同濃度恩度組(恩度1,2mg/kg；恩度2,4mg/kg；恩度3,6mg/kg；1次/d),3個恩度+順鉑組(在3個不同濃度恩度組的基礎上再給予順鉑20μg,隔日1次)。所有實驗用藥均經(jīng)尾靜脈注射,連續(xù)給藥2周。 1.4給藥結(jié)束后觀察1周,測量并記錄腫瘤直徑,所有裸鼠進行稱重,給予水合氯醛麻醉后摘眼取血,然后處死全部裸鼠,進行完整的解剖,包括腫瘤和淋巴結(jié)解剖,以從病理學方面評估轉(zhuǎn)移的存在。 1.5根據(jù)用藥前后裸鼠腫瘤直徑的差異評價各組藥物對腫瘤生長抑制作用；組織切片采用HE染色和免疫組織化學染色診斷,免疫組織化學染色采用免疫酶標法。確定各組轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目,腫瘤組織微淋巴管密度,計算各組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性率。評估腫瘤組織中淋巴管生成的重要指標是組織中的微淋巴管密度,podoplanin蛋白是一種表達于脈管系統(tǒng)內(nèi)皮細胞內(nèi)的特異蛋白,對識別淋巴管內(nèi)皮細胞具有較高的特異性,在NSCLC組織中,podoplanin是合適的淋巴管標記物,采用抗鼠podoplanin蛋白抗體作為一抗,PV-6000作為二抗,DAB溶液作為顯色劑,使表達有podoplanin蛋白的微淋巴管內(nèi)皮細胞著色,再通過高倍鏡下進行微淋巴管計數(shù),五個不同視野的平均值作為微淋巴管密度。比較各組微淋巴管密度、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性率的差異,評價恩度對腫瘤淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移的抑制作用。 1.6通過免疫酶標法檢測腫瘤組織中VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3蛋白表達水平；采用免疫磁珠富集法負性篩選策略和免疫熒光染色檢測實驗裸鼠外周血循環(huán)腫瘤細胞。 2.1選擇2010年1月-2012年8月期間我院胸外科收治的121例Ⅱb-Ⅲa期NSCLC術(shù)后患者分為兩組,對照組58例和觀察組63例； 2.2對照組給予單純化療,包括TP/C方案(多西他賽+順鉑/卡鉑)、NP方案(長春瑞濱+順鉑)、GP/C方案(吉西他濱+順鉑/卡鉑),觀察組在此基礎上增加恩度治療；每個治療周期均評價藥物不良反應情況； 2.3每例患者的治療進行2-4個周期,并于術(shù)后3個月、6個月、9個月和12個月分別評價患者生存情況及肺癌轉(zhuǎn)移情況。 結(jié)果 1.各實驗組腫瘤平均直徑差值明顯小于空白對照組,恩度聯(lián)合順鉑各組腫瘤直徑差值小于單獨使用恩度各組與順鉑組；單獨使用恩度與順鉑的各組之間腫瘤直徑差值無明顯差異。恩度各組與恩度聯(lián)合順鉑各組中,較高濃度恩度組腫瘤直徑差異低于較低濃度組。 2.3個恩度組與3個恩度聯(lián)合順鉑組的淋巴轉(zhuǎn)移陽性率、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目及微淋巴管密度均明顯低于空白對照組與順鉑組；注射較高恩度濃度的恩度聯(lián)合順鉑組與恩度組淋巴轉(zhuǎn)移陽性率、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目及微淋巴管密度低于注射較低恩度濃度的恩度聯(lián)合順鉑組與恩度組；注射相同恩度濃度的恩度聯(lián)合順鉑組與恩度組間無明顯差異；順鉑組淋巴轉(zhuǎn)移陽性率、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目及微淋巴管密度與空白對照組無明顯差異。 3.3個恩度組與3個恩度聯(lián)合順鉑組的VEGF-C,VEGF-D,VEGFR-3表達陽性率,微淋巴管密度均明顯低于空白對照組與順鉑組；注射較高恩度濃度的恩度聯(lián)合順鉑組與恩度組VEGF-C,VEGF-D,VEGFR-3表達陽性率和微淋巴管密度低于注射較低恩度濃度的恩度聯(lián)合順鉑組與恩度組；注射相同恩度濃度的恩度聯(lián)合順鉑組與恩度組間無明顯差異；順鉑組VEGF-C,VEGF-D,VEGFR-3表達陽性率和微淋巴管密度與空白對照組無明顯差異。各組微淋巴管密度與VEGF-C, VEGF-D,VEGFR-3表達陽性率存在顯著正性相關關系。順鉑組,恩度1,恩度2,恩度3及恩度1+順鉑,恩度2+順鉑,恩度3+順鉑各組的循環(huán)腫瘤細胞數(shù)目明顯低于空白對照組,3個恩度組與3個恩度+順鉑組中,較高濃度恩度組的循環(huán)腫瘤細胞數(shù)目低于較低濃度組,恩度聯(lián)合順鉑各組的循環(huán)腫瘤細胞數(shù)目明顯低于單獨使用順鉑或恩度。 4.觀察組患者術(shù)后12個月時出現(xiàn)病情復發(fā)的比例為9.5%,明顯低于對照組的25.9%(p0.05)；觀察組每個治療周期的各類藥物不良反應發(fā)生率與對照組發(fā)生率的差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 5.分別于術(shù)后3個月、6個月、9個月及12個月行全身檢查,包括胸、腹部CT,腦MRI,腹部超聲,全身骨掃描,部分患者行PET-CT檢查。對兩組患者術(shù)后發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的情況進行比較,對照組淋巴轉(zhuǎn)移率明顯高于觀察組。 結(jié)論 1.恩度與順鉑均能抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移,恩度與順鉑聯(lián)合使用對腫瘤生長的抑制作用強于兩者單獨使用； 2.恩度能夠抑制腫瘤微淋巴管生成及腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移,作用大小與濃度有關,順鉑未發(fā)現(xiàn)類似作用； 3.恩度通過抑制腫瘤組織中VEGF-C,VEGF-D的表達,減少組織中VEGFR-3的激活,抑制VEGF-C、D/VEGFR-3信號通道,實現(xiàn)抑制腫瘤淋巴管生成,減少腫瘤細胞經(jīng)淋巴管進入血液,從而減少循環(huán)腫瘤細胞,最終達到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的目的,作用大小與濃度有關。與順鉑聯(lián)合使用能夠更有效的減少循環(huán)腫瘤細胞。 4.非小細胞肺癌患者術(shù)后給予恩度聯(lián)合化療治療,臨床效果確切,術(shù)后一年復發(fā)率降低,藥物不良反應無明顯增加； 5.非小細胞肺癌患者術(shù)后給予恩度聯(lián)合化療,對術(shù)后復發(fā)腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移有一定的抑制作用,強于單純化療。 綜上所述,重組人血管內(nèi)皮抑制素在動物實驗與臨床研究中都表現(xiàn)出了對腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的抑制作用,主要機制為抑制淋巴管生成因子及其受體的表達；恩度還可以通過抑制腫瘤新生血管及淋巴管生成,抑制腫瘤通過脈管系統(tǒng)轉(zhuǎn)移,減少外周血循環(huán)腫瘤細胞,改善患者預后；恩度與常規(guī)化療藥物聯(lián)合使用時能提高對腫瘤生長的抑制作用,降低術(shù)后患者腫瘤復發(fā)率,且不增加藥物毒副作用。本實驗提示在腫瘤治療研究中應該更加關注重組人血管內(nèi)皮抑制素的淋巴管生成抑制作用,為腫瘤的臨床治療提供了一種新的治療思路。
【圖文】：

圖1-5-4.各組腫瘤組織經(jīng)免疫組織化學染色VEGFR-3著色后的圖片X200倍Figure 1-5-4. Coloring VEGFR-3 pictures of tumor tissue by IHC staining in each group 200times圖1-5中每個字母代表的組別：a.空白對照組 e?恩度2 (4mg/kg)b.順鈾組（20iig) f.恩度 2 (4mg/kg) + 順銷(20 ug)c.恩度 1 (2mg/kg) g.恩度3 (6mg/kg)d.恩度 1 (2mg/kg) + 順銷（20 g) h.恩度3 (6mg/kg) + 順銷(20 u g)腫瘤組織采用免疫組織化學染色診斷，染色后組織中有VEGF-C，VEGF-D，VEGFR-3表達的部位和微淋巴管內(nèi)皮細胞呈棕黃色，，隨著恩度給藥濃度增加，對腫瘤組織VEGF-C，VEGF-D,VEGFR_3的表達和淋巴管生成的抑制作用增強，腫瘤組織中VEGF-C，VEGF-D, VEGFR-3的表達和淋巴管生成減少，組織中染色區(qū)域相應減少。Group represention of each alphabet in figure 1-5;

第一章探討恩度對非小細胞肺癌裸鼠模型淋巴轉(zhuǎn)移的抑制作用 Tumor tissues' diagnosis used immunohistochemical staining, micro-lymphatic endothelial ceilsand tumor tissues where VEGF-C，VEGF-D, VEGFR-3 expressed showed brownish-yellow afterstaining.With increasing administration concentrations of endostar，inhibition of VEGF-C,VEGF-D, VEGFR-3 expression and lymphangiogenesis of tumor tissue enhanced, leaded toVEGF-C, VEGF-D, VEGFR-3 expression and lymphangiogenesis decrease in tumor tissue andcorresponding reduction in tissue stained area.
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

相關期刊論文 前7條

1 何平;王偉;任傳利;喬媛媛;張金強;文峰;周蘭萍;劉芳;趙曉航;;負性篩選策略與食管鱗癌循環(huán)腫瘤細胞檢測[J];癌癥進展;2008年04期

2 王艷,朱波,葉明福,陳正堂;podoplanin在非小細胞肺癌組織中的表達及其與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的關系[J];重慶醫(yī)學;2005年11期

3 楊玲,李連弟,陳育德,Donald Maxwell Parkin;中國肺癌死亡趨勢分析及發(fā)病、死亡的估計與預測[J];中國肺癌雜志;2005年04期

4 陳萬青;張思維;鄒小農(nóng);;中國肺癌發(fā)病死亡的估計和流行趨勢研究[J];中國肺癌雜志;2010年05期

5 歐娟娟;耿培亮;李建軍;薩日娜;童晶濤;梁后杰;;重組人血管內(nèi)皮抑素對人結(jié)腸癌淋巴管內(nèi)皮細胞成管抑制作用機制的探討[J];中華腫瘤防治雜志;2010年05期

6 張國明;龐作良;羅洞波;;小鼠肺癌模型的建立及其在順鉑、恩度對比試驗中的應用[J];新疆醫(yī)科大學學報;2009年07期

7 韓立春;邢德君;;恩度聯(lián)合TP方案治療晚期非小細胞肺癌臨床觀察[J];中國腫瘤臨床;2009年21期

本文編號：2530410