【摘要】：背景 肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快,對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。近20年來許多國家都報(bào)道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高,男性肺癌發(fā)病率和死亡率均居所有惡性腫瘤的第一位,女性肺癌發(fā)病率居第二位,死亡率居第一位。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),是最為常見的肺癌,約占肺癌總數(shù)的80-85%,包括鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌,與小細(xì)胞癌相比其癌細(xì)胞生長分裂較慢,擴(kuò)散轉(zhuǎn)移相對較晚,多通過淋巴、血液及腫瘤浸潤等方式進(jìn)行局部侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。如何切斷腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的途徑是目前控制肺癌進(jìn)展的重要課題。 恩度(重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液,Recombinant Human Endostatin Injection)是由我國自主研發(fā)的一種抗癌新藥,為內(nèi)源性血管生成抑制劑,能夠選擇性抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移,達(dá)到抑制腫瘤形成新生血管、切斷腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供給途徑、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的目的。恩度對腫瘤血管生成的抑制作用已有較多研究與報(bào)道,但其對腫瘤淋巴管的生成是否存在類似的抑制作用,相關(guān)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究報(bào)道仍很少見。為此,我們設(shè)計(jì)并進(jìn)行了相關(guān)基礎(chǔ)與臨床研究,以期探討恩度對NSCLC淋巴管生成及淋巴轉(zhuǎn)移的作用。 目的 1.通過建立非小細(xì)胞肺癌裸鼠荷瘤模型,觀察重組人血管內(nèi)皮抑制素對腫瘤動物模型淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移的抑制作用； 2.免疫組織化學(xué)染色法檢測肺癌組織中VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3表達(dá)水平,觀察恩度對VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3表達(dá)水平情況的影響； 3.采用免疫磁珠富集法負(fù)性篩選策略檢測實(shí)驗(yàn)裸鼠外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量,對比空白對照組與各實(shí)驗(yàn)組循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量的差異； 4.對比非小細(xì)胞肺癌術(shù)后單純輔助化療與聯(lián)合恩度進(jìn)行術(shù)后輔助治療的療效差異,根據(jù)術(shù)后定期復(fù)查結(jié)果,分析恩度聯(lián)合化療對于非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后一年復(fù)發(fā)率的影響； 5.根據(jù)患者術(shù)前與術(shù)后復(fù)查的影像學(xué)檢查結(jié)果,對比患者全身淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況,評價恩度對患者術(shù)后腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的抑制作用。 方法 1.1從北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫購買A549人肺癌細(xì)胞株1株,胰蛋白酶-EDTA消化液消化后傳代培養(yǎng),傳至第5代后,A549肺癌細(xì)胞數(shù)量達(dá)到建立裸鼠肺癌模型要求。 1.2BALB/C裸鼠60只,5周齡,雌雄各半,體重均為22-25g之間,購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心,裸鼠飼養(yǎng)在解放軍304醫(yī)院SPF級動物實(shí)驗(yàn)室。裸鼠購進(jìn)后觀察1周,于裸鼠右側(cè)腋窩經(jīng)皮下注射濃度為1×107/m1的A549肺癌細(xì)胞0.2m1,建立裸鼠異種移植荷瘤模型。接種腫瘤細(xì)胞3周后,選取56只建模成功的荷瘤裸鼠,腫瘤平均直徑為7±0.4mm。 1.356只成瘤裸鼠隨機(jī)分為8個小組(n=7),各組間裸鼠體重,腫瘤直徑無顯著性差異,同組雌雄裸鼠分開飼養(yǎng)。包括1個對照組(生理鹽水0.2m1,1次/d),1個順鉑組(順鉑20μg,隔日1次),3個不同濃度恩度組(恩度1,2mg/kg；恩度2,4mg/kg；恩度3,6mg/kg；1次/d),3個恩度+順鉑組(在3個不同濃度恩度組的基礎(chǔ)上再給予順鉑20μg,隔日1次)。所有實(shí)驗(yàn)用藥均經(jīng)尾靜脈注射,連續(xù)給藥2周。 1.4給藥結(jié)束后觀察1周,測量并記錄腫瘤直徑,所有裸鼠進(jìn)行稱重,給予水合氯醛麻醉后摘眼取血,然后處死全部裸鼠,進(jìn)行完整的解剖,包括腫瘤和淋巴結(jié)解剖,以從病理學(xué)方面評估轉(zhuǎn)移的存在。 1.5根據(jù)用藥前后裸鼠腫瘤直徑的差異評價各組藥物對腫瘤生長抑制作用；組織切片采用HE染色和免疫組織化學(xué)染色診斷,免疫組織化學(xué)染色采用免疫酶標(biāo)法。確定各組轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目,腫瘤組織微淋巴管密度,計(jì)算各組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性率。評估腫瘤組織中淋巴管生成的重要指標(biāo)是組織中的微淋巴管密度,podoplanin蛋白是一種表達(dá)于脈管系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的特異蛋白,對識別淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞具有較高的特異性,在NSCLC組織中,podoplanin是合適的淋巴管標(biāo)記物,采用抗鼠podoplanin蛋白抗體作為一抗,PV-6000作為二抗,DAB溶液作為顯色劑,使表達(dá)有podoplanin蛋白的微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞著色,再通過高倍鏡下進(jìn)行微淋巴管計(jì)數(shù),五個不同視野的平均值作為微淋巴管密度。比較各組微淋巴管密度、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性率的差異,評價恩度對腫瘤淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移的抑制作用。 1.6通過免疫酶標(biāo)法檢測腫瘤組織中VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3蛋白表達(dá)水平；采用免疫磁珠富集法負(fù)性篩選策略和免疫熒光染色檢測實(shí)驗(yàn)裸鼠外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞。 2.1選擇2010年1月-2012年8月期間我院胸外科收治的121例Ⅱb-Ⅲa期NSCLC術(shù)后患者分為兩組,對照組58例和觀察組63例； 2.2對照組給予單純化療,包括TP/C方案(多西他賽+順鉑/卡鉑)、NP方案(長春瑞濱+順鉑)、GP/C方案(吉西他濱+順鉑/卡鉑),觀察組在此基礎(chǔ)上增加恩度治療；每個治療周期均評價藥物不良反應(yīng)情況； 2.3每例患者的治療進(jìn)行2-4個周期,并于術(shù)后3個月、6個月、9個月和12個月分別評價患者生存情況及肺癌轉(zhuǎn)移情況。 結(jié)果 1.各實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均直徑差值明顯小于空白對照組,恩度聯(lián)合順鉑各組腫瘤直徑差值小于單獨(dú)使用恩度各組與順鉑組；單獨(dú)使用恩度與順鉑的各組之間腫瘤直徑差值無明顯差異。恩度各組與恩度聯(lián)合順鉑各組中,較高濃度恩度組腫瘤直徑差異低于較低濃度組。 2.3個恩度組與3個恩度聯(lián)合順鉑組的淋巴轉(zhuǎn)移陽性率、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目及微淋巴管密度均明顯低于空白對照組與順鉑組；注射較高恩度濃度的恩度聯(lián)合順鉑組與恩度組淋巴轉(zhuǎn)移陽性率、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目及微淋巴管密度低于注射較低恩度濃度的恩度聯(lián)合順鉑組與恩度組；注射相同恩度濃度的恩度聯(lián)合順鉑組與恩度組間無明顯差異；順鉑組淋巴轉(zhuǎn)移陽性率、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目及微淋巴管密度與空白對照組無明顯差異。 3.3個恩度組與3個恩度聯(lián)合順鉑組的VEGF-C,VEGF-D,VEGFR-3表達(dá)陽性率,微淋巴管密度均明顯低于空白對照組與順鉑組；注射較高恩度濃度的恩度聯(lián)合順鉑組與恩度組VEGF-C,VEGF-D,VEGFR-3表達(dá)陽性率和微淋巴管密度低于注射較低恩度濃度的恩度聯(lián)合順鉑組與恩度組；注射相同恩度濃度的恩度聯(lián)合順鉑組與恩度組間無明顯差異；順鉑組VEGF-C,VEGF-D,VEGFR-3表達(dá)陽性率和微淋巴管密度與空白對照組無明顯差異。各組微淋巴管密度與VEGF-C, VEGF-D,VEGFR-3表達(dá)陽性率存在顯著正性相關(guān)關(guān)系。順鉑組,恩度1,恩度2,恩度3及恩度1+順鉑,恩度2+順鉑,恩度3+順鉑各組的循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目明顯低于空白對照組,3個恩度組與3個恩度+順鉑組中,較高濃度恩度組的循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目低于較低濃度組,恩度聯(lián)合順鉑各組的循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目明顯低于單獨(dú)使用順鉑或恩度。 4.觀察組患者術(shù)后12個月時出現(xiàn)病情復(fù)發(fā)的比例為9.5%,明顯低于對照組的25.9%(p0.05)；觀察組每個治療周期的各類藥物不良反應(yīng)發(fā)生率與對照組發(fā)生率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 5.分別于術(shù)后3個月、6個月、9個月及12個月行全身檢查,包括胸、腹部CT,腦MRI,腹部超聲,全身骨掃描,部分患者行PET-CT檢查。對兩組患者術(shù)后發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的情況進(jìn)行比較,對照組淋巴轉(zhuǎn)移率明顯高于觀察組。 結(jié)論 1.恩度與順鉑均能抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移,恩度與順鉑聯(lián)合使用對腫瘤生長的抑制作用強(qiáng)于兩者單獨(dú)使用； 2.恩度能夠抑制腫瘤微淋巴管生成及腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移,作用大小與濃度有關(guān),順鉑未發(fā)現(xiàn)類似作用； 3.恩度通過抑制腫瘤組織中VEGF-C,VEGF-D的表達(dá),減少組織中VEGFR-3的激活,抑制VEGF-C、D/VEGFR-3信號通道,實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤淋巴管生成,減少腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴管進(jìn)入血液,從而減少循環(huán)腫瘤細(xì)胞,最終達(dá)到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的目的,作用大小與濃度有關(guān)。與順鉑聯(lián)合使用能夠更有效的減少循環(huán)腫瘤細(xì)胞。 4.非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后給予恩度聯(lián)合化療治療,臨床效果確切,術(shù)后一年復(fù)發(fā)率降低,藥物不良反應(yīng)無明顯增加； 5.非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后給予恩度聯(lián)合化療,對術(shù)后復(fù)發(fā)腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移有一定的抑制作用,強(qiáng)于單純化療。 綜上所述,重組人血管內(nèi)皮抑制素在動物實(shí)驗(yàn)與臨床研究中都表現(xiàn)出了對腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的抑制作用,主要機(jī)制為抑制淋巴管生成因子及其受體的表達(dá)；恩度還可以通過抑制腫瘤新生血管及淋巴管生成,抑制腫瘤通過脈管系統(tǒng)轉(zhuǎn)移,減少外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞,改善患者預(yù)后；恩度與常規(guī)化療藥物聯(lián)合使用時能提高對腫瘤生長的抑制作用,降低術(shù)后患者腫瘤復(fù)發(fā)率,且不增加藥物毒副作用。本實(shí)驗(yàn)提示在腫瘤治療研究中應(yīng)該更加關(guān)注重組人血管內(nèi)皮抑制素的淋巴管生成抑制作用,為腫瘤的臨床治療提供了一種新的治療思路。
【圖文】：

圖1-5-4.各組腫瘤組織經(jīng)免疫組織化學(xué)染色VEGFR-3著色后的圖片X200倍Figure 1-5-4. Coloring VEGFR-3 pictures of tumor tissue by IHC staining in each group 200times圖1-5中每個字母代表的組別：a.空白對照組 e?恩度2 (4mg/kg)b.順鈾組（20iig) f.恩度 2 (4mg/kg) + 順銷(20 ug)c.恩度 1 (2mg/kg) g.恩度3 (6mg/kg)d.恩度 1 (2mg/kg) + 順銷（20 g) h.恩度3 (6mg/kg) + 順銷(20 u g)腫瘤組織采用免疫組織化學(xué)染色診斷，染色后組織中有VEGF-C，VEGF-D，VEGFR-3表達(dá)的部位和微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕黃色，，隨著恩度給藥濃度增加，對腫瘤組織VEGF-C，VEGF-D,VEGFR_3的表達(dá)和淋巴管生成的抑制作用增強(qiáng)，腫瘤組織中VEGF-C，VEGF-D, VEGFR-3的表達(dá)和淋巴管生成減少，組織中染色區(qū)域相應(yīng)減少。Group represention of each alphabet in figure 1-5;

第一章探討恩度對非小細(xì)胞肺癌裸鼠模型淋巴轉(zhuǎn)移的抑制作用 Tumor tissues' diagnosis used immunohistochemical staining, micro-lymphatic endothelial ceilsand tumor tissues where VEGF-C，VEGF-D, VEGFR-3 expressed showed brownish-yellow afterstaining.With increasing administration concentrations of endostar，inhibition of VEGF-C,VEGF-D, VEGFR-3 expression and lymphangiogenesis of tumor tissue enhanced, leaded toVEGF-C, VEGF-D, VEGFR-3 expression and lymphangiogenesis decrease in tumor tissue andcorresponding reduction in tissue stained area.
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 何平;王偉;任傳利;喬媛媛;張金強(qiáng);文峰;周蘭萍;劉芳;趙曉航;;負(fù)性篩選策略與食管鱗癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測[J];癌癥進(jìn)展;2008年04期

2 王艷,朱波,葉明福,陳正堂;podoplanin在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J];重慶醫(yī)學(xué);2005年11期

3 楊玲,李連弟,陳育德,Donald Maxwell Parkin;中國肺癌死亡趨勢分析及發(fā)病、死亡的估計(jì)與預(yù)測[J];中國肺癌雜志;2005年04期

4 陳萬青;張思維;鄒小農(nóng);;中國肺癌發(fā)病死亡的估計(jì)和流行趨勢研究[J];中國肺癌雜志;2010年05期

5 歐娟娟;耿培亮;李建軍;薩日娜;童晶濤;梁后杰;;重組人血管內(nèi)皮抑素對人結(jié)腸癌淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞成管抑制作用機(jī)制的探討[J];中華腫瘤防治雜志;2010年05期

6 張國明;龐作良;羅洞波;;小鼠肺癌模型的建立及其在順鉑、恩度對比試驗(yàn)中的應(yīng)用[J];新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2009年07期

7 韓立春;邢德君;;恩度聯(lián)合TP方案治療晚期非小細(xì)胞肺癌臨床觀察[J];中國腫瘤臨床;2009年21期

本文編號：2530410