【摘要】：目的在課題組前期相關(guān)研究的基礎(chǔ)上,應(yīng)用槲皮素干預(yù)大鼠后,以參與膽固醇攝入、轉(zhuǎn)運(yùn)、合成和轉(zhuǎn)化途徑中重要的受體蛋白、限速酶和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子為切入點(diǎn),從酶蛋白活性、基因水平表達(dá)和蛋白水平表達(dá)三個(gè)層次,分析探討槲皮素影響膽固醇代謝的具體途徑和相關(guān)生物學(xué)機(jī)制,以期揭示槲皮素作用的具體靶點(diǎn),為充分認(rèn)識(shí)植物化學(xué)物的健康效應(yīng)和合理應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1.槲皮素對(duì)血脂水平和主動(dòng)脈弓膽固醇含量的影響24只健康雄性Wistar大鼠在體重均衡的基礎(chǔ)上隨機(jī)分為正常對(duì)照組和槲皮素干預(yù)組,每組12只。正常對(duì)照組大鼠喂食AIN-93G配方飼料,槲皮素干預(yù)組大鼠在前期篩選出槲皮素適宜干預(yù)劑量的基礎(chǔ)上,在AIN-93G配方飼料中添加0.4%的槲皮素,分籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食飲水,共喂養(yǎng)5周。喂養(yǎng)期間每天記錄飼料攝入量,每周稱量動(dòng)物體重,密切觀察動(dòng)物生長(zhǎng)情況。應(yīng)用眼眶后靜脈從采血法收集第2周、第4周和第5周大鼠血液,測(cè)定血清中總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triacylglycerol,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)的水平;喂養(yǎng)期結(jié)束后,乙醚麻醉下處死動(dòng)物,分離大鼠主動(dòng)脈弓血管,測(cè)定血管組織中TC、游離膽固醇(free cholesterol,FCH)和膽固醇酯(cholesteryl esters,CE)的含量。2.槲皮素對(duì)低密度脂蛋白受體表達(dá)的影響按上述方法喂養(yǎng)動(dòng)物5周后,處死大鼠取肝臟和主動(dòng)脈弓組織,觀察LDL-C攝入過(guò)程中低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor,LDLR)的表達(dá)變化。應(yīng)用Real-time PCR的方法檢測(cè)肝臟和主動(dòng)脈弓組織中LDLR在基因水平表達(dá)的變化,應(yīng)用Western blotting的方法檢測(cè)肝臟和主動(dòng)脈弓組織中LDLR在蛋白水平表達(dá)的變化。3.槲皮素對(duì)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的影響按上述方法喂養(yǎng)動(dòng)物5周后,處死大鼠取肝臟和主動(dòng)脈弓組織,觀察膽固醇外排轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中重要的轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白表達(dá)和調(diào)控的變化。應(yīng)用Real-time PCR的方法檢測(cè)肝臟和主動(dòng)脈弓組織中三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1(ATP-binding cassette transporter G1,ABCG1)和上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子肝X受體α(liver X receptorα,LXRα)在m RNA水平的表達(dá),應(yīng)用Western blotting的方法檢測(cè)肝臟和主動(dòng)脈弓組織中ABCA1、ABCG1和LXRα在蛋白水平表達(dá)的變化。4.槲皮素對(duì)肝臟膽固醇合成途徑的影響按上述方法喂養(yǎng)動(dòng)物5周后,處死大鼠迅速摘取肝臟,觀察膽固醇合成途徑中限速酶羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(hydroxymethyl glutaryl coenzyme A reductase,HMG CR)的活性、表達(dá)與調(diào)控的變化。應(yīng)用超速離心法分離大鼠肝臟微粒體后,采用酶偶聯(lián)法測(cè)定肝臟微粒體中HMG CR的活性。應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)HMG CR和上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白-2(sterol regulatory element-binding protein-2,SREBP-2)在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),應(yīng)用Western blotting的方法檢測(cè)HMG CR和SREBP-2在蛋白水平的表達(dá)變化。5.槲皮素對(duì)肝臟膽固醇轉(zhuǎn)化途徑的影響按上述方法喂養(yǎng)動(dòng)物5周后,處死大鼠迅速摘取肝臟,觀察膽固醇轉(zhuǎn)化途徑中限速酶膽固醇7α羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)的活性、表達(dá)與調(diào)控的變化。應(yīng)用超速離心法分離大鼠肝臟微粒體后,應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)的方法,以CYP7A1催化內(nèi)源性膽固醇生成7α-羥膽固醇,進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)?α-羥-4膽甾烯-3-酮(7α-hydroxy-4-cholesten-3-one,HCO)的多少表示肝臟微粒體中CYP7A1的活性。應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)CYP7A1和上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子法尼酯受體(farnesoid X receptor,FXR)和LXRα在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),應(yīng)用Western blotting的方法檢測(cè)CYP7A1、FXR和LXRα在蛋白水平的表達(dá)變化。結(jié)果1.槲皮素對(duì)血脂水平和主動(dòng)脈弓膽固醇含量的影響動(dòng)物喂養(yǎng)期間,對(duì)照組和槲皮素干預(yù)組動(dòng)物的飼料攝入量和動(dòng)物體重,從第1周至第5周均未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),可以排除因處理因素不同造成的影響。通過(guò)測(cè)定第2周、第4周和第5周三個(gè)時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物血脂水平,發(fā)現(xiàn)在0.4%槲皮素干預(yù)5周時(shí),大鼠血清中LDL-C的濃度顯著高于正常對(duì)照組(P0.05),而在第2 w和第4 w時(shí)血清中LDL-C的含量在兩組比較中未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。血清中的TC、TG和HDL-C含量?jī)山M比較均未出現(xiàn)差異(P0.05)。槲皮素干預(yù)組與對(duì)照組相比,主動(dòng)脈弓TC、FCH和CE的含量與對(duì)照組相比較均顯著下降(P0.05)。2.槲皮素對(duì)LDLR表達(dá)的影響0.4%的槲皮素干預(yù)動(dòng)物5周后,大鼠肝臟和主動(dòng)脈弓組織中LDLR在基因水平的表達(dá)均顯著上調(diào)(P0.05),同時(shí)LDLR在蛋白水平的表達(dá)也顯著升高(P0.05)�？梢愿嗟臄z入血液循環(huán)中的LDL-C。3.槲皮素對(duì)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的影響0.4%的槲皮素干預(yù)動(dòng)物5周后,可以顯著提升主動(dòng)脈弓組織中ABCA1和ABCG1在m RNA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),同時(shí)上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子LXRα在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)也顯著升高(P0.05)。在肝臟中,ABCA1在m RNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)兩組比較未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但是在槲皮素干預(yù)組中,肝臟ABCG1在m RNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組(P0.05),同時(shí),上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子LXRα在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)也顯著升高(P0.05)。4.槲皮素對(duì)肝臟膽固醇合成的影響0.4%的槲皮素干預(yù)動(dòng)物5周后,通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)340nm波長(zhǎng)處NADPH吸光度值的變化,可以精確測(cè)定大鼠肝臟微粒體中HMG CR的活性。結(jié)果顯示,盡管大鼠肝臟中HMG CR的活性有下降的趨勢(shì),但是與正常對(duì)照組比較未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P0.05),HMG CR在m RNA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)與對(duì)照組比較卻明顯下調(diào)(P0.05),酶蛋白在蛋白水平的表達(dá)兩組比較未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著變化(P0.05)。上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SREBP-2在m RNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)均未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P0.05)。5.槲皮素對(duì)肝臟膽固醇轉(zhuǎn)化的影響0.4%的槲皮素干預(yù)動(dòng)物5周后,通過(guò)HPLC檢測(cè)大鼠肝臟微粒體中HCO量的多少,可以直接反映出CYP7A1的活性。結(jié)果顯示,0.4%的槲皮素干預(yù)組動(dòng)物肝臟CYP7A1的活性與正常對(duì)照組相比較顯著升高(P0.05),肝臟CYP7A1在m RNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)也明顯上調(diào)(P0.05)。上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子FXR在m RNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)兩組比較未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但是另一重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子LXRα在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)顯著升高(P0.05)。結(jié)論1.0.4%槲皮素干預(yù)Wistar大鼠5周后,可以明顯降低主動(dòng)脈弓血管等組織中TC、FCH和CE的含量,引發(fā)血清中LDL-C濃度的升高,說(shuō)明槲皮素具有影響機(jī)體膽固醇的代謝和改變膽固醇在體內(nèi)分布的作用。2.0.4%槲皮素干預(yù)Wistar大鼠5周后,可以顯著上調(diào)肝臟和主動(dòng)脈弓組織中LDLR在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達(dá),有利于攝入循環(huán)中的LDL-C,因此具有調(diào)節(jié)LDLR途徑的作用。3.0.4%槲皮素干預(yù)Wistar大鼠5周后,可以通過(guò)上調(diào)主動(dòng)脈弓組織中LXRα在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)促進(jìn)ABCA1和ABCG1的m RNA表達(dá),同時(shí)在肝臟也是通過(guò)上調(diào)LXRα在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達(dá),促進(jìn)ABCG1在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達(dá),說(shuō)明槲皮素可以加速組織細(xì)胞中膽固醇的外排轉(zhuǎn)運(yùn),有利于降低組織細(xì)胞中膽固醇的濃度。4.盡管槲皮素對(duì)膽固醇的代謝具有調(diào)節(jié)作用,但是根據(jù)槲皮素對(duì)HMG CR的活性、表達(dá)與調(diào)控的研究結(jié)果,可以確定槲皮素對(duì)膽固醇的合成途徑影響甚微,槲皮素調(diào)節(jié)膽固醇代謝作用的靶點(diǎn)不在于合成途徑。5.0.4%槲皮素干預(yù)Wistar大鼠5周后,可以提升CYP7A1的活性和表達(dá)水平,但是這種調(diào)節(jié)作用是通過(guò)上調(diào)LXRα在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的,并非是由FXR引起的。槲皮素可以通過(guò)促進(jìn)膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化,促進(jìn)體內(nèi)膽固醇外排。
【圖文】：

Fig 3-11 Melting curve of hepatic ABCA1 and β-actin mRNA12 所示，槲皮素干預(yù)組大鼠肝臟中 ABCA1 的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)（P>0.05）。1.4

所示，與對(duì)照組相比較，槲皮素干預(yù)組大鼠肝臟FXR轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)無(wú)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R285.5

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