【摘要】：右美托咪定(dexmedetomidine)是一種高選擇性α2-腎上腺素能受體激動劑,具有中樞性抗交感和抗焦慮作用,能產(chǎn)生近似自然睡眠的鎮(zhèn)靜作用；同時具有一定的鎮(zhèn)痛、利尿作用,對呼吸無明顯抑制。自1999年美國FDA批準其用于ICU機械通氣患者最初24h的鎮(zhèn)靜以來,已經(jīng)在臨床手術(shù)麻醉、圍術(shù)期及重癥監(jiān)護室鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。國外有學(xué)者報道,右美托咪定可應(yīng)用于燒傷患者的手術(shù)與換藥,但其在燒傷領(lǐng)域的應(yīng)用還不夠廣泛。右美托咪定對燒傷后機體病理生理過程的影響及相關(guān)機制目前也尚未完全闡明。 心臟是機體的循環(huán)動力器官。有研究表明,嚴重?zé)齻?0min,心肌細胞骨架受損,30min至1h心肌血流量開始明顯減少,心功能降低,肌鈣蛋白漏出增多,病理形態(tài)出現(xiàn)明顯變化,心肌細胞凋亡增加。這種即早出現(xiàn)的心肌損害不僅可引起心功能不全,還可能成為嚴重?zé)齻菘撕腿斫M織器官缺血缺氧損害的重要啟動因素。因此,針對燒傷后心肌損害機制的研究和如何防治嚴重?zé)齻笮募p害一直是國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點。右美托咪定的主要藥理作用是降低交感神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性,削弱應(yīng)激反應(yīng),減少應(yīng)激激素的分泌,并預(yù)防圍術(shù)期心肌缺血的發(fā)生。國外有研究表明,右美托咪定預(yù)處理可減輕心肌缺血再灌注損傷；國內(nèi)也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),右美托咪定預(yù)處理可以減輕缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞凋亡。另外,還有大量基礎(chǔ)研究表明,右美托咪定可以通過減輕機體炎癥反應(yīng),產(chǎn)生器官保護作用。右美托咪定對燒傷后心肌損傷的影響及機制如何,目前尚不清楚。由于嚴重?zé)齻笮募p害的機制包括：機體過度的應(yīng)激反應(yīng)、心肌細胞缺血缺氧、缺血再灌注損傷、失控性炎癥反應(yīng)、氧利用及能量代謝障礙等,并且心肌細胞出現(xiàn)不同程度的凋亡。因此,我們推測右美托咪定對燒傷后心肌細胞可發(fā)揮類似的保護及抗凋亡作用。 目前,已有大量研究證實心肌細胞凋亡是嚴重?zé)齻缙谛墓δ軗p害的原因之一,但具體機制尚未完全闡明。傳統(tǒng)的細胞凋亡途徑主要包括死亡受體和線粒體途徑,兩者均通過誘導(dǎo)caspase級聯(lián)反應(yīng)激活caspase-3,導(dǎo)致細胞凋亡。近年的研究顯示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)也與細胞凋亡密切相關(guān)。在ERS早期,細胞通過一系列蛋白表達調(diào)控----未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)；但如果ERS持續(xù)而嚴重,則激活凋亡通路而誘發(fā)細胞凋亡。有研究表明,減輕ERS的藥物或者措施可以減少缺血再灌注損傷引起的心肌損傷及凋亡。如果右美托咪定能減輕燒傷后心肌損傷,其機制是否與影響心肌細胞凋亡有關(guān)?是否有涉及ERS介導(dǎo)的凋亡通路?這些均有待進一步研究探討。 ERS是真核細胞內(nèi)自我保護機制的一種反應(yīng),對維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用,其過程及介導(dǎo)凋亡的通路十分復(fù)雜。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78, GRP78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶,是UPR反應(yīng)的標志分子之一,也是調(diào)控ERS的關(guān)鍵分子之一。沒有未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)時,GRP78能結(jié)合并抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的特殊感受器,一旦出現(xiàn)未折疊蛋白質(zhì),GRP78就從感受器上移位到未折疊蛋白上,使感受器得以激活。蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-Like ER kinase, PERK)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最重要的感受器。ERS時,與PERK結(jié)合在一起的GRP78由于位移到大量的未折疊和錯誤折疊蛋白質(zhì)上,而使得PERK蛋白暴露,進而發(fā)生二聚化和自身磷酸化。磷酸化的PERK又使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外側(cè)的eIF2a發(fā)生磷酸化修飾,從而使得蛋白質(zhì)合成啟動過程暫停,緩解了蛋白質(zhì)的進一步堆積。如果ERS持續(xù)存在,磷酸化的PERK則通過ATF4激活下游的相關(guān)凋亡通路,誘導(dǎo)細胞凋亡。因此,GRP78與P-PERK表達的上調(diào)標志著ERS的發(fā)生,并且可以反映ERS激活的程度。C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)是ERS特異的轉(zhuǎn)錄因子,是ERS發(fā)揮介導(dǎo)細胞凋亡功能的最主要蛋白。正常情況下,CHOP表達十分低下,當ERS持續(xù)劇烈存在時,IRE1、PERK、ATF6的活化均對CHOP產(chǎn)生誘導(dǎo),促使其激活,并大量表達,從而誘導(dǎo)細胞凋亡,其中PERK通路與CHOP的活化關(guān)系最為密切,因為PERK-eIF2a-ATF4是CHOP蛋白表達所必須的復(fù)合物。Caspase-12是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族成員之一,位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜胞質(zhì)一側(cè)。Caspase-12只有被激活后才發(fā)揮介導(dǎo)凋亡的作用。目前相關(guān)研究表明,有三種途徑可以激活Caspase-12:IRE1途徑,m-鈣蛋白酶途徑和Caspase-7途徑,而這三種途徑均與ERS有關(guān)。燒傷后心肌細胞ERS的具體過程尚未完全闡明,右美托咪定對上述ERS標志性蛋白的影響如何也有待研究探討。 綜上所述,本研究擬以SD大鼠為研究對象,并建立大鼠30%體表面積燒傷模型,應(yīng)用組織病理學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)電泳等分子生物學(xué)手段,比較不同劑量右美托咪定對嚴重燙傷大鼠心肌損傷及炎癥狀態(tài)的影響,觀察嚴重燙傷大鼠整個休克期ERS相關(guān)的標志性蛋白及心肌細胞凋亡水平的變化及趨勢,并進一步探討右美托咪定對嚴重燙傷大鼠心肌細胞凋亡的影響及其機制,為將來深入闡明右美托咪定對嚴重?zé)齻笮募p傷的影響機制以及右美托咪定在燒傷患者圍術(shù)期的廣泛應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。 第1章右美托咪定對嚴重燙傷大鼠血清cTnI、CK-MB、TNF-α以及心肌組織TNF-α的影響 目的探討不同劑量右美托咪定對燙傷大鼠心肌損傷及炎癥反應(yīng)的影響。 方法以SD大鼠為研究對象,將其分為3組(n=32)：燙傷組(A組)、燙傷+右美托咪定10μg/kg組(B組)、燙傷+右美托咪定30μg/kg組(C組)。建立大鼠30%體表面積燒傷模型后,按Parkland公式補液,分別用相應(yīng)劑量右美托咪定腹腔注射處理,于傷后3、6、12、24h,檢測大鼠心肌組織腫瘤壞死因子α(TNF-α)以及血清肌鈣蛋白I (cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、TNF-α水平變化。數(shù)據(jù)資料以x±s表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。不同處理組在各時間點測得的相應(yīng)指標水平比較采用兩因素析因設(shè)計資料的方差分析,組間比較采用LSD法。P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果A、B、C三組大鼠燙傷后血清cTnI、CK-MB、TNF-α以及心肌組織TNF-α水平逐漸升高,傷后12h達高峰,傷后24h出現(xiàn)下降趨勢(P0.05)。與A組比較,B組、C組大鼠血清cTnI水平下降,且C組下降較B組更顯著(P均0.05)；傷后6、12、24h B組大鼠血清CK-MB水平較A組下降(P均0.05),傷后3、6、12、24h C組大鼠血清CK-MB水平較A組下降(P均0.05),傷后3、12、24h C組大鼠血清CK-MB水平顯著低于B組(P均0.05)；傷后12h B組大鼠血清TNF-α水平較A組下降(P=0.019),傷后3、6、12、24h C組大鼠血清TNF-α水平較A組下降(P均0.05),傷后6、12、24h C組大鼠血清TNF-α水平顯著低于B組(P均0.05)；傷后6、12、24h B組大鼠心肌組織TNF-α水平較A組下降(P0.05),傷后6、12、24h C組大鼠心肌組織TNF-α水平較A組下降(P均0.05),傷后12h C組大鼠心肌組織TNF-α水平顯著低于B組(P=0.00) 結(jié)論嚴重燙傷后早期大鼠出現(xiàn)心肌損傷,于燙傷后12h血清cTnI、 CK-MB、TNF-α以及心肌組織TNF-α水平達到峰值。右美托咪定可減輕大鼠燙傷后心肌損傷并降低血漿及心臟局部TNF-α水平,且腹腔注射301μg/kg所產(chǎn)生的心肌保護效應(yīng)較腹腔注射10μg/kg顯著。 第2章嚴重燙傷大鼠早期心肌細胞凋亡以及心肌組織GRP78、P-PERK、 CHOP表達的變化及意義 目的觀察大鼠嚴重燙傷后心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達的變化,探討其在心肌細胞凋亡過程中的意義及可能機制。 方法健康成年雄性SD大鼠64只,將其分為8組(n=8)：正常對照組、燙傷后1、3、6、12、24、48、72h組。建立大鼠30%體表面積燒傷模型后,按Parkland公式補液。對照組大鼠于假傷后即刻,其余7組大鼠于相應(yīng)時間點獲取左室心肌組織,采用蛋白印記以及細胞凋亡的原位標記(TUNEL)法,觀察大鼠心肌組織GRP78、P-PERK、CHOP表達以及心肌細胞凋亡程度的變化。計量資料以x±s表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。各指標數(shù)據(jù)采用完全隨機單因素方差分析,組間比較采用LSD法(方差齊)或Dunnett's T3法(方差不齊)。P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果各組大鼠心肌GRP78水平表達有差異(F=133.240,P=0.000),燙傷后大鼠心肌GRP78水平較傷前升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),與傷后1、3、72h相比,傷后6-48h大鼠心肌GRP78進一步升高(P0.01),從均值上看傷后48h大鼠心肌GRP78表達水平達到峰值,但傷后6-48h之間大鼠心肌GRP78表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。各組大鼠心肌P-PERK水平表達有差異(F=154.733,P=0.000),燙傷后3h開始大鼠心肌P-PERK水平較傷前逐漸升高,并于傷后12h-24h達到峰值水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),而后逐漸回落,傷后72h恢復(fù)至傷前水平(P0.05)。各組大鼠心肌CHOP水平表達有差異(F=223.871,P=0.000),燙傷后6h開始大鼠心肌CHOP水平較傷前逐漸升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),并于傷后12h達到峰值水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),而后逐漸回落,傷后72h恢復(fù)至傷前水平(P0.05)。各組大鼠心肌細胞凋亡水平有差異(F=322.860,P=0.000),燙傷后1h開始大鼠心肌細胞凋亡水平較傷前逐漸升高,并于傷后12h達到峰值水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),而后逐漸回落,傷后72h仍高于傷前水平(P0.05)。 結(jié)論大鼠嚴重燙傷早期心肌細胞存在明顯的凋亡,凋亡最高峰在傷后12h。嚴重燙傷后1h大鼠心肌細胞ERS相關(guān)蛋白表達開始逐漸增加,整個燙傷早期階段心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)一直持續(xù),并參與了部分的心肌細胞凋亡過程,且CHOP通路所介導(dǎo)的細胞凋亡可能于傷后6h開始,傷后12h達到高峰。 第3章右美托咪定對嚴重燙傷大鼠心肌細胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡通路相關(guān)蛋白的影響 目的右美托咪定對燒傷后心肌細胞凋亡以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡通路相關(guān)蛋白的影響。 方法健康成年雄性SD大鼠24只,將其分為3組(n=8)：對照組(C組)、燙傷組(B組)、燙傷+右美托咪定30μg/kg組(D組)。建立大鼠30%體表面積燒傷模型后,按Parkland公式補液,分別用相應(yīng)劑量右美托咪定腹腔注射處理,于傷后12h獲取心肌組織,通過光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡以及免疫組織化學(xué)、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記(TUNEL)和蛋白印跡等方法觀察右美托咪定對嚴重燙傷大鼠心肌組織病理形態(tài)與凋亡以及GRP78、P-PERK、 CHOP、Caspase-12這些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達的影響。計量資料以x±s表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。各指標數(shù)據(jù)采用完全隨機單因素方差分析,組間比較采用LSD法(方差齊)或Dunnett's T3法(方差不齊)。P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果與C組比較,B組和D組大鼠心肌組織GRP78、P-PERK、CHOP、 Caspase-12表達水平以及凋亡指數(shù)均升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與B組比較,D組大鼠心肌組織GRP78、P-PERK、CHOP、Caspase-12表達水平以及凋亡指數(shù)均減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),光鏡下見C組大鼠心肌細胞結(jié)構(gòu)正常,肌絲排列整齊,細胞界限清晰；B組大鼠心肌細胞水腫、間質(zhì)充血、心肌纖維變性,橫紋模糊不清甚至消失,出現(xiàn)廣泛的肌纖維波浪狀排列；D組大鼠心肌細胞少量水腫,心肌纖維排列基本正常,病變程度較B組有所減輕；電鏡下見C組大鼠心肌細胞結(jié)構(gòu)正常,肌絲、肌節(jié)排列整齊,線粒體未見腫脹,細胞核正常,核膜完整,間質(zhì)未見水腫及炎癥細胞侵潤,毛細血管內(nèi)皮細胞無腫脹,管腔內(nèi)未見淤血及血栓形成；B組大鼠心肌細胞肌絲、肌節(jié)排列紊亂,結(jié)構(gòu)模糊不清,肌漿網(wǎng)擴張明顯,部分肌絲灶性溶解,部分節(jié)段細胞膜破壞,可見部分線粒體漏出及固縮,間質(zhì)毛細血管內(nèi)皮細胞腫脹；D組大鼠心肌細胞肌絲、肌節(jié)排列基本整齊,線粒體輕度腫脹,僅個別線粒體漏出,肌漿網(wǎng)輕度擴張,細胞膜基本完整無斷裂,少量間質(zhì)水腫,毛細血管內(nèi)皮細胞大致正常。 結(jié)論右美托咪定可以減輕嚴重燙傷大鼠心肌損傷及凋亡,并抑制心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡通路相關(guān)蛋白表達,其減少細胞凋亡的機制可能與抑制CHOP和caspase-12這兩條凋亡通路有關(guān)。 論文主要結(jié)論 1、嚴重燙傷后早期大鼠出現(xiàn)心肌損傷,血漿cTnI及CK-MB水平升高,于燙傷后12h達到峰值。燙傷后大鼠全身及心肌局部出現(xiàn)炎癥反應(yīng),血漿及心臟局部TNF-α水平升高,燙傷后12h達到峰值。右美托咪定可減輕大鼠燙傷后心肌損傷并降低血漿及心臟局部TNF-α水平,且腹腔注射30μg/kg所產(chǎn)生的心肌保護效應(yīng)較腹腔注射10μg/kg顯著。 2、大鼠嚴重燙傷早期心肌細胞存在明顯的凋亡,凋亡最高峰在傷后12h。嚴重燙傷后1h大鼠心肌細胞ERS相關(guān)蛋白表達開始逐漸增加,整個燙傷早期階段心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)一直持續(xù),并參與了部分的心肌細胞凋亡過程,且CHOP通路所介導(dǎo)的細胞凋亡可能于傷后6h開始,傷后12h達到高峰。 3、右美托咪定可以減輕嚴重燙傷大鼠心肌損傷及凋亡,并抑制心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡通路相關(guān)蛋白表達,其減少細胞凋亡的機制可能與抑制CHOP和caspase-12這兩條凋亡通路有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R614

【參考文獻】

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1 陳盼;趙明;蔣鵬;王勝軍;谷騰飛;;鹽酸右美托咪定預(yù)處理對缺血-再灌注損傷大鼠心肌Bax和Bcl-2表達的影響[J];重慶醫(yī)學(xué);2012年16期

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本文編號：2448394