【摘要】：多發(fā)性硬化是一種常見(jiàn)的、不可預(yù)測(cè)的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘為主要病理改變的神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病,是在遺傳易感的基礎(chǔ)上,與環(huán)境因素共同作用發(fā)生的自身免疫性疾病。其發(fā)病率較高,呈慢性病程,傾向于青壯年罹患,肢體及認(rèn)知功能可同時(shí)受損,致殘率高,長(zhǎng)期、嚴(yán)重影響患者的生活,帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),全球多發(fā)性硬化的患病人口約為250萬(wàn)。我國(guó)目前尚無(wú)確切的流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計(jì),但從文獻(xiàn)研究及個(gè)案報(bào)道來(lái)看,多發(fā)性硬化在我國(guó)的發(fā)病率亦有逐漸上升的趨勢(shì)。 目的： 本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)比較研究的方法,觀察溫膽湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠癥狀及病程改善、病理改變、免疫調(diào)節(jié)等方面的影響,探討溫膽湯在多發(fā)性硬化中的治療機(jī)制及作用,為多發(fā)性硬化臨床治療做有益的探索。 方法： 1按隨機(jī)原則把40只SPF級(jí)6-8周齡Wistar雌性大鼠分成正常組、模型組、西藥組、中藥組及中西藥治療組5組,每組8只。 2選用二次免疫法進(jìn)行造模。 3在第1天注射免疫的同時(shí)給予灌胃。各組大鼠實(shí)驗(yàn)期間每間隔24小時(shí)連續(xù)16天給予灌胃。其中正常組大鼠給予正常生理鹽水(2ml/只)灌服；模型組大鼠給予正常生理鹽水(2ml/只)灌服；西藥組大鼠給予醋酸潑尼松(1mg/k)灌服；中藥組大鼠給予溫膽湯煎劑(11.88g/kg)灌服；中西藥治療組大鼠給予溫膽湯煎劑(11.88g/kg)及醋酸潑尼松(1mg/kg)灌服。同時(shí)每間隔24小時(shí)連續(xù)16天觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、飲水量、進(jìn)食、體重等情況,并進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。 4各組大鼠于第17天采用過(guò)度麻醉方法處死,并采集標(biāo)本,進(jìn)行組織病理、免疫組化檢測(cè)TLR9的表達(dá)、ELISA檢測(cè)IFN-γ及IL-2的含量、QPCR檢查T(mén)LR2及TLR4的表達(dá)。 結(jié)果： 1正常組大鼠未出現(xiàn)臨床癥狀；模型組大鼠于第2天開(kāi)始陸續(xù)發(fā)病,第3天逐漸出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損癥狀,第10天達(dá)到發(fā)病高峰,發(fā)病率為8/8,死亡率為2/8；西藥組大鼠于第2天開(kāi)始陸續(xù)發(fā)病,第3天出現(xiàn)CNS受損癥狀,第12天達(dá)到發(fā)病高峰,發(fā)病率為8/8,死亡率為2/8；中藥組大鼠于第2天陸續(xù)發(fā)病,第5天逐漸出現(xiàn)CNS受損癥狀,第13天達(dá)到發(fā)病高峰,發(fā)病率為8/8,死亡率為1/8；中西藥治療組大鼠其中6只于第5天開(kāi)始陸續(xù)發(fā)病,第8天開(kāi)始出現(xiàn)CNS受損癥狀,發(fā)病率為3/4,死亡率為0/8。 2治療后各組臨床癥狀神經(jīng)功能評(píng)分比較,正常組無(wú)癥狀,模型組最高。與正常組比較,模型組、西藥組、中藥組、中西藥治療組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；與模型組比較,西藥組、中西藥治療組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；與西藥組對(duì)比,中藥組、中西藥治療組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；中藥組與中西藥治療組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3治療后各組潛伏期比較,正常組正常,模型組潛伏期最短,發(fā)病最快,中西藥治療組潛伏期最長(zhǎng),發(fā)病時(shí)間最慢。與模型組比較,中藥組、中西藥治療組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；與西藥組對(duì)比,中藥組、中西藥治療組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；中西藥治療組與中藥組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；模型組與西藥組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 4治療后各組癥狀達(dá)高峰時(shí)間比較,正常組正常,模型組最快。中西藥治療組發(fā)病潛伏期長(zhǎng),取材時(shí)大鼠發(fā)病時(shí)間較短,故暫不討論中西藥治療組癥狀達(dá)高峰時(shí)間。與模型組比較,西藥組、中藥組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；中藥組與西藥組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 5正常組未發(fā)��；模型組、西藥組、中藥組所有大鼠均發(fā)��；中西藥治療組有6只大鼠發(fā)病。模型組及西藥組均死亡2只大鼠；中藥組死亡1只大鼠；正常組及中西藥治療組均未出現(xiàn)大鼠死亡。 6各組大鼠造模當(dāng)天體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。造模后第10天、第16天各組大鼠體重比較,正常組最重,模型組及西藥組最輕。與正常組比較,模型組、西藥組、中藥組、中西藥治療組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；與模型組比較,中藥組、中西藥治療組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；與西藥組對(duì)比,中藥組、中西藥治療組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),模型組與西藥組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；中藥組與中西藥治療組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。模型組、西藥組、中藥組、中西藥治療組大鼠體重第10天與第16天體重對(duì)比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),并且各組大鼠第16天體重大于第10天。 7HE染色：正常組大鼠腦及脊髓未見(jiàn)異常。模型組腦和脊髓切片發(fā)現(xiàn)白質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)小血管擴(kuò)張,部分小血管壁增厚,血管周?chē)写罅垦仔约?xì)胞浸潤(rùn),浸潤(rùn)細(xì)胞以淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主,形成“袖套”狀改變�！靶涮住睜罱Y(jié)構(gòu)在脊髓白質(zhì)及灰、白質(zhì)交界處多見(jiàn),炎性浸潤(rùn)主要分布在脊髓前腳白質(zhì)、灰白質(zhì)交界區(qū)及正中裂血管周?chē)?并且炎性浸潤(rùn)部位及程度與臨床癥狀密切相關(guān),白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散,呈空泡樣改變,而腦實(shí)質(zhì)則主要分布于腦室周?chē)桶踪|(zhì)內(nèi),灰質(zhì)基本不受累。神經(jīng)元細(xì)胞未見(jiàn)明顯病變。西藥組、中藥組與模型組相比,“袖套”狀結(jié)構(gòu)均有所減少,血管周?chē)仔约?xì)胞明顯減少,白質(zhì)內(nèi)見(jiàn)散在較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。中西藥治療組腦及脊髓白質(zhì)內(nèi)“袖套”狀結(jié)構(gòu)明顯減少,血管周?chē)匆?jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn),白質(zhì)內(nèi)散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。 8脫髓鞘染色：正常組脊髓白質(zhì)髓鞘染色呈均勻一致的藍(lán)色,無(wú)脫髓鞘改變。模型組脊髓白質(zhì)出現(xiàn)灶狀或片狀的髓鞘脫失,軸突腫脹甚至消失,藍(lán)色髓鞘染色區(qū)域減少、顏色變淺,顯示髓鞘脫失。西藥組、中藥組、中西藥治療組脫髓鞘減輕,藍(lán)色髓鞘染色區(qū)域增多,以中西藥治療組減輕最為明顯。 9免疫組化：TLR9陽(yáng)性細(xì)胞中有棕黃色顆粒定位于胞漿、胞膜。正常組大鼠大腦皮質(zhì)各層細(xì)胞,表層細(xì)胞如分子層、外顆粒層、外錐體細(xì)胞層基本無(wú)著色,表明其表達(dá)TLR9量很少；深層如內(nèi)顆粒層、內(nèi)錐體細(xì)胞層以星形細(xì)胞著色為主,也有錐體細(xì)胞,顏色均很淡,呈弱陽(yáng)性。模型組大腦皮質(zhì)的分子層、外顆粒層、外錐體細(xì)胞層和多形細(xì)胞層的TLR9表達(dá)量都比正常組明顯增加。西藥組、中藥組大腦皮質(zhì)的TLR9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及陽(yáng)性強(qiáng)度均較模型組有所降低。中西藥治療組大腦皮質(zhì)的TRL-9陽(yáng)性細(xì)胞面積及著色強(qiáng)度均較模型組顯著下降。 10治療后各組IL-2比較,模型組最高。與正常組比較,模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),西藥組、中藥組、中西藥治療組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 11治療后各組IFN-γ比較,模型組最高。與正常組比較,模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),西藥組、中藥組、中西藥治療組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 12治療后各組TLR2比較,正常組最低,模型組最高。與正常組比較,模型組、西藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；與模型組比較,西藥組、中藥組、中西藥治療組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；正常組、中藥組、中西藥治療組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 13治療后各組TLR4比較,正常組最低,模型組最高。與正常組比較,模型組、中藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；與模型組比較,西藥組、中藥組、中西藥治療組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),正常組、西藥組及中西藥治療組組間對(duì)比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論： 1Wistar大鼠通過(guò)二次免疫法成功建立EAE模型。 2EAE大鼠一般狀況差,體重減輕,出現(xiàn)明顯的神經(jīng)系統(tǒng)受損癥狀。 3EAE大鼠潛伏期短,出現(xiàn)臨床癥狀后較快達(dá)高峰,中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、脫髓鞘改變,腦組織炎性細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ產(chǎn)生增多,Toll樣受體2、4、9表達(dá)增多。 4EAE可能的機(jī)制是：在感染、外傷、缺血缺氧等條件刺激下,TLRs識(shí)別各種PMAs,促使細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ等表達(dá)增加,使血腦屏障受損,炎性細(xì)胞和致炎性細(xì)胞因子如IL-2、IFN-γ進(jìn)入CNS,進(jìn)一步激活CNS內(nèi)免疫細(xì)胞表達(dá),從而加劇了炎癥反應(yīng)和脫髓鞘改變。 5溫膽湯可降低EAE大鼠發(fā)病率及死亡率,延長(zhǎng)其發(fā)病潛伏期及臨床癥狀達(dá)高峰時(shí)間,同時(shí)減輕高峰期臨床癥狀,減輕腦脊髓炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),減輕脫髓鞘病變,說(shuō)明溫膽湯對(duì)EAE大鼠發(fā)病具有防治作用。 6溫膽湯可減少EAE大鼠IL-2與IFN-γ mRNA的表達(dá)。 7溫膽湯可降低EAE大鼠腦組織TLR2、4、9的表達(dá)。 8溫膽湯可抑制DC Toll樣受體的抗原提呈作用,通過(guò)抑制Thl細(xì)胞增殖、抑制Thl細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子,從多個(gè)環(huán)節(jié)上抑制EAE異常的細(xì)胞免疫應(yīng)答過(guò)程,抑制了體內(nèi)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞、NK、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等的激活,調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞介質(zhì)的表達(dá)和活化,打破了炎癥得以放大和持續(xù)的正反饋環(huán)路,從而抑制和逆轉(zhuǎn)EAE的發(fā)生及發(fā)展。 9聯(lián)用溫膽湯和醋酸潑尼松治療EAE療效更佳。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R277.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2427899