發(fā)布時間：2018-12-14 12:45

【摘要】：第一部分胰腺干細胞誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化的研究目的:干細胞是機體及其各種組織細胞的初始來源,其最為顯著的生物學特征是既有自我更新和不斷增殖的能力,又有多向分化的潛能。干細胞根據(jù)不同來源可分為胚胎干細胞(embryonic stem,ES)、誘導性多潛能干細胞(induced pluripotent stem,i PS)及成體干細胞。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)是骨髓中除了造血干細胞之外的另一大類干細胞,體外培養(yǎng)形態(tài)呈成纖維細胞樣,近年來發(fā)現(xiàn)還可以分化成許多種類的組織細胞,如中胚層的軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、內(nèi)皮細胞細胞;外胚層的神經(jīng)元細胞;內(nèi)胚層的肝卵圓細胞等。越來越多的實驗證據(jù)顯示BMSC還有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、促進血管新生、營養(yǎng)等作用,與胚胎干細胞或其他組織特異的干細胞相比,間充質(zhì)干細胞有許多優(yōu)勢,如容易獲得、少倫理限制和低免疫原性。這使得BMSC成為一種在組織工程、再生醫(yī)學和自身免疫疾病治療方面理想的種子細胞。然而直接移植BMSC往往由于靶向性不足而使得治療效果不佳。胰腺干細胞(pancreatic stem cells,PSCS)是一類存在于胎兒和成年胰腺組織中的成體干細胞,是保持著未達終末分化狀態(tài)的具有自我更新和多分化潛能的細胞。由于胰腺干細胞來源十分匱乏,并且存在免疫排斥等問題,且直接移植或者誘導其形成類胰島樣細胞團后移植,治療效果也不理想。本實驗采用PSCS與BMSC共培養(yǎng)方法,以期定向誘導BMSC向胰腺細胞的方向分化,為其在糖尿病中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。用光鏡觀察原代分離培養(yǎng)的BMSC和PSCS細胞形態(tài),用流式細胞術(shù)和免疫熒光法鑒定BMSC和PSCS,RT-PCR和免疫熒光法檢測BMSC誘導前后的定向分化標志基因,以探討PSCS對BMSC定向誘導分化的效果。方法:1原代骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)采用全骨髓貼壁法,分離培養(yǎng)原代骨髓間充質(zhì)干細胞。麻醉處死SD大鼠(約80g),將股骨取出,放入裝有PBS的平皿中,沖洗3次。剪除股骨近端骨骺,用5 m L注射器吸取5%FBS-MSCM培養(yǎng)基,從遠端骨骺洞隙進針,反復沖洗骨髓腔,直到股骨變?yōu)樯n白色。輕柔吹打骨髓液,室溫800 rpm離心5 min。PBS沖洗2次,加入2~3 m L培養(yǎng)基,接種培養(yǎng)瓶中。37℃培養(yǎng)。24 h后全量換液,換液時用PBS沖洗兩次,去除雜細胞,約5~7 d細胞密度達到80%,可進行第一次傳代。其后每次約2~3 d即可傳代。光鏡觀察細胞形態(tài)變化。2流式細胞術(shù)鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞收集P3代生長狀態(tài)良好的細胞,胰酶消化,1000 rpm離心5 min,用PBS洗滌細胞3次,細胞計數(shù)后,各管中分別依次加入CD105、CD90、CD44、CD34、CD45抗體,同時每管樣品設(shè)立同型對照。避光室溫孵育40 min,PBS清洗細胞3次,以除去未結(jié)合抗體,加入500μL PBS重懸細胞,流式細胞儀進行檢測分析。3原代胰腺干細胞提取培養(yǎng)采用膠原酶消化聯(lián)合差速貼壁法,分離培養(yǎng)原代胰腺干細胞。麻醉處死SD乳鼠,取出胰芽,放入盛有預冷的PBS的青霉素玻璃瓶中,用PBS輕柔沖洗3次,去除PBS。加入500μL預熱的0.5 mg/m L膠原酶V,在37℃水浴中輕柔晃動10 min,反復消化,收集上清液,直到組織變?yōu)榧毶碃�。在收集的上清液中加�?%FBS-hanks液,終止消化,輕柔吹打成細胞懸液。將細胞懸液室溫800 rpm離心5 min,沉淀用Hanks液沖洗兩次,反復離心洗滌3次后,沉淀加入3 m L 5%FBS-1640培養(yǎng)基輕柔吹打,移入培養(yǎng)瓶中,37℃培養(yǎng)。提取之后每隔1 h將上層懸浮細胞轉(zhuǎn)入新瓶。收集3、4次差速貼壁后的細胞,培養(yǎng)。2~3 d后細胞呈現(xiàn)鵝卵石樣,繼續(xù)培養(yǎng)1~2 d,細胞密度基本達到80%,即可傳代。光鏡觀察細胞形態(tài)變化。4免疫熒光法鑒定胰腺干細胞將生長狀態(tài)良好的P2代細胞接種于預先放有滅菌玻片的六孔板中,生長24小時,融合至80%后將玻片取出,進行Nestin和Ngn3的細胞免疫熒光染色,以檢測其分布和表達情況。5胰腺干細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)在成功分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞和胰腺干細胞的基礎(chǔ)上,實驗分為:骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)組、胰腺干細胞(PSCS)組、共培養(yǎng)(Co-Culture,CC)組。BMSC組:收集P3代BMSC,以1×106的密度接種于六孔板內(nèi)。PSCS組:收集P2代PSCS,以1×106的密度接種于六孔板內(nèi)。CC組:BMSC以1×106的密度接種于六孔板內(nèi),PSCS以1×106的密度接種于Transwell小室中,建立BMSC和PSCS的共培養(yǎng)模型。共培養(yǎng)10 d后檢測胰腺干細胞標志Nestin和Ngn3表達情況。6 RT-PCR方法檢測nestin、ngn3的m RNA表達水平Trizol一步法分別提取各組Transwell小室下層細胞中總RNA,用RT-PCR方法檢測nestin、ngn3 m RNA表達。用β-actin做內(nèi)參。7免疫熒光法檢測Nestin、Ngn3的表達情況共培養(yǎng)后,免疫熒光法鑒定各組Transwell小室下層細胞的Nestin、Ngn3蛋白的表達情況。結(jié)果:1原代骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)變化剛分離提取的細胞懸浮于培養(yǎng)基中,呈球形;24 h全量換液時觀察細胞開始貼壁生長,但大部分細胞仍為圓形;72 h之后部分細胞開始出現(xiàn)突起和偽足,形態(tài)呈多角形,并呈現(xiàn)集落式生長;傳至P3代,形態(tài)大部分為長梭形、類成纖維樣,并呈漩渦樣生長。2流式細胞術(shù)鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,P3代BMSC均表達干細胞標志分子CD44、CD90、CD105,陽性率分別為89.4%、94.5%、99.8%,而造血細胞分子標志CD34、CD45呈陰性表達,陽性率分別為9.48%、8.22%。說明提取培養(yǎng)的原代細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。3原代胰腺干細胞的形態(tài)變化剛分離提取的細胞懸浮于培養(yǎng)基中,由于膠原酶V消化后的細胞中含有大量的成纖維細胞,并且成纖維細胞較胰腺干細胞易貼壁,因此每隔1 h差速貼壁1次;差速2~3次后可見前幾瓶細胞大量貼壁,并呈長梭形,乃典型成纖維細胞。此后的細胞在24 h后呈現(xiàn)鵝卵石樣,貼壁生長。4免疫熒光法鑒定胰腺干細胞免疫熒光法檢測結(jié)果顯示,P2代胰腺干細胞明顯表達其標志分子Nestin、Ngn3蛋白。說明提取培養(yǎng)的原代細胞為胰腺干細胞。5共培養(yǎng)后各組nestin、ngn3的m RNA表達情況與骨髓間充質(zhì)干細胞組比,PSCS組及CC組nestin及ngn3 m RNA水平均顯著升高(P0.05),有統(tǒng)計學差異。與PSCS組比,CC組nestin m RNA水平顯著降低(P0.05),有統(tǒng)計學差異。與PSCS組比,CC組ngn3 m RNA水平無統(tǒng)計學差異(P0.05)。說明與PSCS共培養(yǎng)后,骨髓間充質(zhì)干細胞表達胰腺干細胞標志基因nestin及ngn3。6共培養(yǎng)后細胞的Nestin、Ngn3的表達情況與骨髓間充質(zhì)干細胞組比,PSCS組及CC組Nestin及Ngn3蛋白細胞分布明顯,且含量均顯著升高(P0.01),有統(tǒng)計學差異。與PSCS組相比,CC組Nestin及Ngn3蛋白分布和含量無明顯差異(P0.05)。說明與PSCS共培養(yǎng)后,骨髓間充質(zhì)干細胞中胰腺干細胞標志Nestin及Ngn3蛋白被誘導合成,向胰腺細胞方向分化。第二部分定向誘導分化的骨髓間充質(zhì)干細胞對糖尿病胰島的修復作用目的:糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是一種全球范圍內(nèi)的流行病,因體內(nèi)胰島素相對或絕對不足或靶細胞對胰島素敏感性降低或胰島素本身存在結(jié)構(gòu)上的缺陷而引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂的一種慢性疾病,其基本特征為血糖水平升高。目前,糖尿病的治療主要以降血糖類藥物為主,但藥物治療并未取得滿意的治療效果,只是控制血糖的水平,并未從根本上解決胰腺組織胰島功能不足的問題。近年來隨著再生醫(yī)學研究領(lǐng)域的發(fā)展,干細胞治療逐步興起,這為解決上述難題提供了新思路。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem,BMSC)是一種在組織工程、再生醫(yī)學和自身免疫疾病治療方面理想的種子細胞。然而直接移植BMSC往往由于靶向性不足而使得治療效果不佳。胰腺干細胞(pancreatic stem cells,PSCS)是一類存在于胎兒和成年胰腺組織中的成體干細胞,是保持著未達終末分化狀態(tài)的具有自我更新和多分化潛能的細胞。但是由于胰腺干細胞來源十分匱乏,并且存在免疫排斥等問題,直接移植或者誘導其形成類胰島樣細胞團后移植往往達不到理想的治療效果。本實驗用胰腺干細胞(PSCS)誘導骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)定向分化后,尾靜脈注射糖尿病大鼠,以探討其對糖尿病胰島功能的修復作用。用健康雄性SD大鼠進行實驗,鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)復制DM模型,各治療組尾靜脈注射細胞,測定血糖、體重變化,測定糖耐量曲線,利用DIR-碘化物染色細胞并示蹤;并取大鼠胰腺于光鏡下進行形態(tài)學觀察,利用ELISA試劑盒檢測大鼠血清胰島素、C肽含量,利用糖原檢測試劑盒檢測大鼠肝糖原、肌糖原含量,利用Western blot方法檢測大鼠胰腺組織胰島素蛋白表達情況,旨在進一步探討誘導后細胞逆轉(zhuǎn)DM的整體功效及作用,為臨床治療提供實驗依據(jù)。方法:1動物分組與取材健康雄性SD大鼠60只,隨機分為5組,正常組(Con)5只,其余55只腹腔注射STZ溶液制備DM模型。注射3天后,測空腹血糖高于16.7mmol/L,為造模成功。造模成功45只,再將其隨機分成4組:病理組(DM,9只),PBS組(PBS,5只),BMSC組(BMSC,15只),共培養(yǎng)組(CC,16只)。以上4組均20-25℃室溫下喂養(yǎng)。BMSC組、共培養(yǎng)組尾靜脈注射各組細胞5×106個,每兩周注射1次,共3次。飼養(yǎng)5周后,麻醉處死。2測血糖和體重耳緣靜脈取血,用血糖儀檢測并記錄注射STZ前、后1周、2周、3周、4周、5周的血糖變化。并記錄注射STZ前、后1周、2周、3周、4周、5周的體重變化。3檢測糖耐量的變化第2次注射細胞后第7天上午(覓食結(jié)束),將大鼠禁食6 h。6 h后耳緣靜脈采血,用血糖儀檢測血糖并記錄,然后腹腔注射葡萄糖(100mg/m L,注射劑量按1 mg/g體重給予)。分別在注射即刻、0.25 h、0.5 h、1 h、2 h時間點測血糖并記錄,用于描繪糖耐量曲線。4細胞標記與示蹤DIR-碘化物染色細胞,尾靜脈注射7天后活體成像儀拍照。5光鏡下觀察胰腺組織形態(tài)學變化取胰腺組織,4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋、切片及HE染色,光鏡下觀察胰腺形態(tài)學變化。6胰島素ELISA試劑盒檢測大鼠血清胰島素含量7 C肽ELISA試劑盒檢測大鼠血清C肽含量8糖原檢測試劑盒檢測大鼠肝糖原、肌糖原含量9 Western blot方法檢測大鼠胰腺組織胰島素蛋白表達情況結(jié)果:1大鼠的一般表現(xiàn)以及血糖和體重變化情況造模成功的大鼠逐漸出現(xiàn)消瘦,皮毛無光澤、疏松,反應(yīng)遲鈍,多飲、多尿、多食、生長遲緩等癥狀。隨著實驗進行,DM組和PBS組體征更加明顯,而BMSC組及CC組明顯有好轉(zhuǎn)。各組大鼠入選時血糖和體重無顯著性差異。整個實驗中,BMSC組及CC組平均體重均無顯著性差異(P0.05),以上兩組均顯著高于DM組及PBS組(P0.01)。BMSC組及CC組平均體血糖均無顯著性差異(P0.05),以上兩組均顯著低于DM組及PBS組(P0.01)(Fig.1)。2大鼠糖耐量實驗與DM組、PBS組相比,BMSC組及CC組糖耐量曲線變化明顯較優(yōu)(P0.01)(見Fig.2)。3細胞標記與示蹤活體成像結(jié)果顯示,移植后的細胞可在體內(nèi)腹部集中。4光鏡下觀察胰腺組織形態(tài)學變化Con組:胰島數(shù)目較多,輪廓規(guī)則整齊,胰島體積大,胰島內(nèi)細胞排列整齊,細胞核居中,胞漿均勻,細胞界限清楚DM組及PBS組:胰島數(shù)目中度至重度減少,胰島體積中度至重度減小,細胞空泡變性,細胞核偏向一側(cè),可見調(diào)亡。BMSC組:胰島數(shù)目中度減少,胰島體積中度減小,胰島內(nèi)細胞數(shù)減少,可見空泡變性。CC組:胰島數(shù)目較多,胰島體積輕度減小,胰島內(nèi)細胞數(shù)輕度減少,偶見空泡變性,胞漿較均勻。5 ELSIA檢測各組大鼠血清中胰島素、C肽含量的變化與Con組比,DM組、PBS組、BMSC組、CC組胰島素及C肽水平顯著降低(P0.05),具有統(tǒng)計學差異。與BMSC組比CC組胰島素水平明顯升高(P0.05),具有統(tǒng)計學差異。6糖原檢測試劑盒檢測大鼠肝糖原、肌糖原含量的變化與Con組比,DM組、PBS組、BMSC組、CC組肝糖原及肌糖原水平顯著降低(P0.05),具有統(tǒng)計學差異。與BMSC組比CC組肝糖原水平明顯升高(P0.05),具有統(tǒng)計學差異,而與BMSC組比CC組肌糖原水平并無統(tǒng)計學差異(P0.05)。7 Western Blot法檢測大鼠胰島素含量的變化與Con組比,DM組及PBS組胰島素水平顯著降低(P0.05),均有統(tǒng)計學差異。而與Con組比CC組胰島素水平并無統(tǒng)計學差異(P0.05)。結(jié)論:1與胰腺干細胞共培養(yǎng),可成功誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為胰腺干細胞樣細胞。2 BMSC可以有效改善糖尿病大鼠病情。3誘導分化的骨髓間充質(zhì)干細胞,對糖尿病胰島功能的修復作用靶向性更好。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R587.1

【參考文獻】

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本文編號：2378634