【摘要】：研究背景及意義：髖部骨折是指從股骨頭至小轉(zhuǎn)子以下5cm這一區(qū)域內(nèi)所發(fā)生的股骨近端骨折,包括股骨頸骨折、股骨粗隆間骨折和轉(zhuǎn)子下骨折,臨床上以股骨頸骨折和股骨粗隆間骨折最為常見,占據(jù)了髖部骨折的90%以上。老年人因其特殊的體質(zhì)及相關(guān)基礎(chǔ)疾病,成為該病最為廣泛的受累群體,其發(fā)生率隨年齡增長而逐漸上升�，F(xiàn)有臨床研究資料顯示：87%-96%的髖部骨折病人年齡60歲,老年髖部骨折具有很高的致殘率(27%-36%)及致死率(2.7%-5.0%)。對(duì)于老年髖部骨折的患者,如何獲得一個(gè)理想的臨床轉(zhuǎn)歸,這一直是臨床工作者的研究熱點(diǎn)�，F(xiàn)代炎癥理論學(xué)說認(rèn)為：創(chuàng)傷可以觸發(fā)炎癥反應(yīng),但并不是所有的創(chuàng)傷都可以引發(fā)不可控制的全身性炎癥反應(yīng)。因?yàn)楫?dāng)創(chuàng)傷觸發(fā)炎癥介質(zhì)釋放時(shí),創(chuàng)傷周圍組織及機(jī)體系統(tǒng)也會(huì)相應(yīng)的啟動(dòng)和分泌抑炎物質(zhì),從而控制創(chuàng)傷誘發(fā)的炎癥。只有當(dāng)機(jī)體承受創(chuàng)傷超過其耐受能力時(shí),機(jī)體內(nèi)促炎／抑炎平衡被打破,才會(huì)誘發(fā)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)及多器官功能衰竭。老年患者由于機(jī)體生理機(jī)能儲(chǔ)備下降,從而易誘發(fā)創(chuàng)傷性炎癥反應(yīng),即使是一個(gè)輕微的創(chuàng)傷都可能誘發(fā)嚴(yán)重的自身破壞性炎癥介質(zhì)釋放,而抗炎介質(zhì)不足以抑制炎癥的發(fā)展。最近國內(nèi)外研究表明：老年髖部骨折患者較高的致殘率及致死率與創(chuàng)傷后的炎癥應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。因此,探索老年髖部骨折創(chuàng)傷后炎癥應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制,尋找新的可能的干預(yù)靶點(diǎn),無疑對(duì)降低老年髖部骨折的并發(fā)癥發(fā)生率及死亡率具有重要意義。內(nèi)共生學(xué)說(endosymbiont hypothesis)認(rèn)為真核細(xì)胞是由真核祖細(xì)胞吞入噬氧細(xì)菌共生進(jìn)化而來,即細(xì)菌被真核生物吞噬后,在長期的共生過程中,相互適應(yīng),逐漸演變,形成了線粒體。細(xì)菌進(jìn)化論證實(shí)線粒體在形態(tài)、染色反應(yīng)、化學(xué)組成、物理性質(zhì)、活動(dòng)狀態(tài)、遺傳體系等方面與細(xì)菌有非常大的相似性。因此,創(chuàng)傷后組織細(xì)胞破裂釋放線粒體,線粒體成分通過線粒體損傷相關(guān)分子模式(mitochondrial DAMPs, MTDs),激活機(jī)體自身固有免疫,促發(fā)與膿毒癥相似的炎性反應(yīng)。MTDs包括甲酰肽和線粒體DNA (mitochondrial DNA, mtDNA),其中線粒體DNA可活化細(xì)胞內(nèi)TLR9 (Toll-Like Receptor),促發(fā)多條炎性信號(hào)傳導(dǎo)通路,引起全身性炎性反應(yīng),造成遠(yuǎn)隔器官的損傷(以肺損傷最常見)。大量臨床研究表明,肺部感染是老年人髖部骨折最常見的并發(fā)癥之一,而由肺部感染導(dǎo)致的多器官功能衰竭則是其最常見的死亡原因。髖部骨折創(chuàng)傷及手術(shù)打擊可引起損傷組織的mtDNA釋放,促發(fā)炎癥反應(yīng),從而導(dǎo)致機(jī)體免疫功能異常及遠(yuǎn)隔器官損傷(以肺損傷最常見),這與骨折后肺部感染、膿毒血癥及多器官功能衰竭等并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)。老年人由于衰老所致的免疫代償能力減弱,在遭受髖部骨折創(chuàng)傷及手術(shù)打擊時(shí),誘發(fā)全身性炎癥反應(yīng)的免疫功能異常及遠(yuǎn)隔器官損傷的可能性更大,程度往往也更嚴(yán)重,更容易罹患感染性并發(fā)癥而死亡。目前關(guān)于髖部骨折后mtDNA的釋放模式及其相關(guān)炎癥反應(yīng)機(jī)制的研究較少,尚缺乏機(jī)制性研究及有效的干預(yù)手段,且國內(nèi)外針對(duì)老年群體髖部骨折后自身炎癥反應(yīng)的相關(guān)研究仍較罕見,這與目前全球人口老齡化特征不符。因此,探索老年髖部骨折后mtDNA的釋放模式及其相關(guān)炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制,尋找新的可能的干預(yù)靶點(diǎn),無疑對(duì)降低老年髖部骨折并發(fā)癥發(fā)生率及死亡率具有重要意義。第一章髖部骨折后mtDNA的釋放及TLR9/NF-KB通路激活的實(shí)驗(yàn)性研究目的(1)觀察髖部骨折后mtDNA的釋放模式,同時(shí)對(duì)比老年髖部骨折模型與成年髖部骨折模型之間mtDNA釋放模式的差異。(2)研究髖部骨折后mtDNA釋放與炎癥反應(yīng)之間的相關(guān)性,同時(shí)初步探討髖部骨折后mtDNA釋放與炎癥TLR9/NF-KB通路之間的相關(guān)性。材料與方法(1)40只成年雄性SD大鼠及40只老年雄性SD大鼠分別被隨機(jī)分成sham組和骨折組。兩個(gè)骨折組老鼠接受麻醉、插管及骨折操作處理,兩個(gè)sham組老鼠接受除骨折操作以外的相關(guān)處理。各組老鼠分4批,5個(gè)／批分別于操作處理結(jié)束后8、24、48及72 h處死,取血標(biāo)本、肺泡灌洗液及肺組織標(biāo)本。(2)通過肺組織病理切片組織學(xué)評(píng)分、肺泡灌洗液蛋白含量測定、髓過氧化物酶(MPO)活性和中性白細(xì)胞彈性酶(NE)濃度測定評(píng)估肺損傷程度,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)觀測血標(biāo)本及肺泡灌洗液中IL-6和IL-10的濃度,蛋白質(zhì)印跡法(western blotting)檢測磷酸化NF-kB蛋白含量、TLR-9蛋白的含量和NF-kB亞基P65蛋白含量變化。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測血清mtDNA濃度。(3)應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,方差齊時(shí),總體均數(shù)的比較采用單向方差分析(one-way ANOVA),各組間多重比較采用Bonferroni法；方差不齊時(shí),總體均數(shù)的比較采用Welch法,各組間多重比較采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。兩樣本均數(shù)比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果(1)兩個(gè)骨折組老鼠血清內(nèi)mtDNA、IL-6和IL-10的濃度在髖部骨折后8、24、48及72 h較對(duì)應(yīng)的sham組均明顯升高(P1：老年骨折組vs老年sham組；P2：年輕骨折組vs年輕sham組。除IL-10在72h時(shí)P2=0.124外,所有P值均0.05),同時(shí)老年骨折組血清內(nèi)mtDNA、IL-6和IL-10濃度在髖部骨折后四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于年輕骨折組(除IL-6在8h和48h時(shí)P值分別為0.242和0.055外,所有P值均0.05)。(2)兩個(gè)骨折組老鼠肺泡灌洗液內(nèi)蛋白含量、IL-6和IL-10的濃度在骨折后8、24、48及72 h較對(duì)應(yīng)的sham組均明顯升高(P1：老年骨折組vs老年sham組；P2：年輕骨折組vs年輕sham組。除IL-10在72h時(shí)P2=0.340外,所有P值均0.05),同時(shí)老年骨折組肺泡灌洗液內(nèi)蛋白含量、IL-6和IL-10濃度在髖部骨折后四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于年輕骨折組(所有P值均0.05)。(3)兩個(gè)骨折組老鼠肺組織病理切片組織學(xué)評(píng)分、肺組織內(nèi)MPO活性、NE濃度以及NF-kB及TLR-9蛋白含量在骨折后8、24、48及72 h較對(duì)應(yīng)的sham組均明顯升高(所有P值均0.05),同時(shí)老年骨折組肺組織病理切片組織學(xué)評(píng)分、肺組織內(nèi)MPO活性、NE濃度以及NF-kB及TLR-9蛋白含量在髖部骨折后四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于年輕骨折組(除8h時(shí)MPO的P=0.254外,所有P值均0.05)。(4)與血清IL-6(B=-0.003,P=0.178)和IL-10 (B=0.025,P=0.000)相比較,mtDNA (B=0.965, P=0.000)與肺病理性評(píng)分具有更高的相關(guān)性。結(jié)論(1)髖部骨折可引起mtDNA的釋放、系統(tǒng)性炎癥及肺損傷。(2)在相同髖部骨折打擊下,老年骨折組大鼠較年輕骨折組大鼠遭受了更嚴(yán)重的系統(tǒng)性炎癥及肺損傷。(3)髖部骨折后mtDNA的釋放以及TLR9/NF-κB通路的激活可能是創(chuàng)傷后系統(tǒng)性炎癥及肺損傷的原因。第二章MtDNA活化TLR9/NF-κB通路引發(fā)系統(tǒng)性炎癥及急性肺損傷的實(shí)驗(yàn)性研究目的(1)研究mtDNA與系統(tǒng)性炎癥及急性肺損傷之間的相關(guān)性。(2)初步探討mtDNA與炎癥TLR9/NF-κB通路在系統(tǒng)性炎癥及急性肺損傷病理過程中的作用。材料與方法(1)20只成年雄性SD大鼠及20只老年雄性SD大鼠分別被隨機(jī)分成sham組和mtDNA組。兩個(gè)mtDNA組老鼠接受麻醉、插管及mtDNA注射操作處理,兩個(gè)sham組老鼠接受除mtDNA注射操作以外的相關(guān)處理。各組老鼠于操作處理結(jié)束后24h處死,取血標(biāo)本、肺泡灌洗液及肺組織標(biāo)本。(2)通過肺組織病理切片組織學(xué)評(píng)分、肺泡灌洗液蛋白含量測定、MPO活性和NE濃度測定評(píng)估肺損傷程度,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)觀測血標(biāo)本及肺泡灌洗液中IL-6和IL-10的濃度,蛋白質(zhì)印跡法(western blotting)檢測TLR-9蛋白和NF-κB亞基P65蛋白的含量變化。(3)應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,方差齊時(shí),總體均數(shù)的比較采用單向方差分析(one-way ANOVA),各組間多重比較采用Bonferroni法；方差不齊時(shí),總體均數(shù)的比較采用Welch法,各組間多重比較采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。兩樣本均數(shù)比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果(1)兩個(gè)mtDNA組老鼠血清內(nèi)IL-6和IL-10的濃度在mtDNA注射后24h較對(duì)應(yīng)的sham組均明顯升高(所有P0.05)。(2)兩個(gè)mtDNA組老鼠肺泡灌洗液內(nèi)蛋白含量、IL-6和IL-10的濃度在mtDNA注射后24h較對(duì)應(yīng)的sham組均明顯升高(所有P0.05)。(3)兩個(gè)mtDNA組老鼠肺組織病理評(píng)分、肺組織內(nèi)MPO活性、NE濃度、NF-κB及TLR-9蛋白表達(dá)在mtDNA注射后24 h較對(duì)應(yīng)的sham組均明顯升高(所有P0.05)。結(jié)論血清mtDNA濃度升高可導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥及肺損傷,這可能與炎癥TLR9/NF-κB通路的激活有關(guān)。第三章MtDNA對(duì)支氣管上皮細(xì)胞生理功能的影響目的探討mtDNA對(duì)支氣管上皮細(xì)胞生理功能的影響。材料與方法使用SD大鼠支氣管上皮細(xì)胞行培養(yǎng),待細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)建后分sham組和mtDNA組,將mtDNA加入mtDNA組細(xì)胞培養(yǎng)液中干預(yù)24h后,使用細(xì)胞跨膜電阻(TEER)法檢測單層細(xì)胞通透性的變化,使用ELISA測定細(xì)胞內(nèi)IL-6和IL-10的表達(dá),Western Blot法檢測支氣管上皮細(xì)胞粘附連接蛋白(E-cadherin, β-catenin)、緊密連接蛋白(Occludin, ZO-1)、TLR-9蛋白和NF-κB亞基P65蛋白的表達(dá)水平,細(xì)胞免疫熒光法檢測支氣管上皮細(xì)胞連接蛋白(E-cadherin, β-catenin, Occludin和ZO-1)的分布情況。應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果數(shù)據(jù)。結(jié)果mtDNA作用支氣管上皮細(xì)胞24h后,可使上皮細(xì)胞TEER顯著下降(t=9.016,P=0.001), FITC-右旋糖苷通透性(Pa/Pc)顯著增加(t=-4.022,P=0.016), IL-6、IL-10的表達(dá)水平增高,NF-κB P65及TLR-9蛋白表達(dá)量顯著增加,黏附連接蛋白E-cadherin及緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)水平減少。細(xì)胞免疫熒光顯示mtDNA可導(dǎo)致細(xì)胞膜連接蛋白(E-cadherin, β-catenin, Occludin和ZO-1)的連續(xù)性及完整性破壞。結(jié)論mtDNA通過改變支氣管上皮細(xì)胞連接蛋白的分布及表達(dá),破壞肺上皮細(xì)胞屏障功能,這與TLR9/NF-κB炎癥通路的激活以及IL-6、IL-10的釋放有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R683
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本文編號(hào)：
2364123
