【摘要】：1目的 本研究觀察大鼠呼吸系統(tǒng)癥狀體征及肺功能，檢測COPD肺氣虛證大鼠輔助T細(xì)胞（Th）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、樹突狀細(xì)胞（DC）、熱休克蛋白（HSP70）、基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)（MMPs/TIMPs）、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）、JAKs/STATs信號(hào)通路、T-bet、RORγt、GATA變化，同時(shí)觀察六味補(bǔ)氣膠囊對上述指標(biāo)的干預(yù)，探討六味補(bǔ)氣膠囊防治COPD肺氣虛證大鼠的作用機(jī)制。 2方法 2.1動(dòng)物分組 將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、模型空白組（以下簡稱模空組）、模型安慰劑組（以下簡稱模安組）、六味補(bǔ)氣膠囊預(yù)防組（以下簡稱六預(yù)組）、六味補(bǔ)氣膠囊治療組（以下簡稱六味補(bǔ)氣組）、金水寶組、脾氨肽組，每組10只。 2.2模型復(fù)制 除正常組大鼠外，其余大鼠于實(shí)驗(yàn)第1天、14天采用10%水合氯醛麻醉，手術(shù)暴露氣管，注入1mg.mL-1脂多糖200μL至氣管內(nèi)。脂多糖滴入的次日，將大鼠置于動(dòng)物氣霧吸入儀中，用50g鋸末加7.11g香煙煙絲混和點(diǎn)燃煙熏，每日煙熏1次，每次30min。造模周期28d。COPD模型成功標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)肺組織影像學(xué)、肺功能及肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。于第22天改煙熏次數(shù)為3次/天。二次復(fù)制肺氣虛證模型成功依據(jù)肺功能及大鼠生物學(xué)癥狀、體征變化，大鼠生物學(xué)癥狀、體征變化包括反映肺氣虛有無的一般情況、活動(dòng)量、毛發(fā)、體質(zhì)量、飲食量、咳嗽、呼吸頻率等，其中呼吸頻率為大鼠平靜呼吸時(shí)每分鐘呼吸次數(shù)。 2.3藥物干預(yù) 于模型復(fù)制第1天開始，模空組、模安組、六預(yù)組大鼠預(yù)防給藥劑量如下：�？战M大鼠未予任何藥物或安慰劑；模安組大鼠予生理鹽水，按照10mL·kg-1·d-1劑量灌服，一天一次，連續(xù)灌服28d；六預(yù)組大鼠予六味補(bǔ)氣膠囊混懸液，按照0.4g·kg-1·d-1（相當(dāng)于臨床成人常規(guī)用量的10倍）劑量灌服，一天一次，連續(xù)灌服28d。模型復(fù)制周期28d后治療組給藥，給藥劑量按照體表面積計(jì)算得出。正常組、模型組灌服生理鹽水10mL·kg-1·d-1，六味補(bǔ)氣組灌服六味補(bǔ)氣膠囊混懸液0.4g·kg-1·d-1，金水寶組灌服金水寶膠囊混懸液0.495g·kg-1·d-1，脾氨肽組灌服脾氨肽水溶液0.33mg·kg-1·d-1，各藥物組劑量均相當(dāng)于成人常規(guī)臨床用量的10倍，1次/天，共給藥30d。 2.4指標(biāo)檢測 分別于預(yù)防給藥28d及治療給藥30d后觀察和檢測以下指標(biāo)：呼吸系統(tǒng)癥狀體征、肺功能、肺組織病理形態(tài)學(xué)變化，血清細(xì)胞因子、Th1、Th2、Th17細(xì)胞變化，外周血Treg表達(dá)、肺組織DC、HSP70表達(dá)，肺組織MMPs/TIMPs、JAKs/STATs信號(hào)通路、T-bet、RORγt、GATA變化。 3結(jié)果 3.1COPD肺氣虛證大鼠指標(biāo)表達(dá)及相關(guān)性分析 3.1.1COPD肺氣虛證大鼠呼吸系統(tǒng)改變 COPD肺氣虛證大鼠出現(xiàn)蜷伏少動(dòng)，拱背蜷臥，撮毛，食量減少，毛失光澤、發(fā)黃、易脫落，體質(zhì)量較正常組減輕；模型組呼吸急促，呼吸頻率明顯高于正常組，呼吸道有分泌物從口鼻流出，偶可聞及咳嗽及氣道痰鳴音，隨著造模時(shí)間的延長。與正常組比較，模型組大鼠肺功能參數(shù)FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC降低；肺系數(shù)、肺泡炎積分及病理學(xué)總積分升高。3.1.2COPD肺氣虛證大鼠細(xì)胞因子變化及相關(guān)性分析 COPD肺氣虛證大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-12升高，IL-10、IL-13、IL-35表達(dá)降低。肺功能參數(shù)FEV0.3與IL-10呈正相關(guān)，F(xiàn)EV0.3/FVC與IL-13呈正相關(guān)，PEF與IL-35呈正相關(guān)，肺泡炎積分與IL-6呈正相關(guān)，肺病理學(xué)積分與IL-1β、IL-12呈正相關(guān)。肺功能參數(shù)FVC與IL-6呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)EV0.3/FVC與IL-1β呈負(fù)相關(guān)，呼吸頻率與IL-13呈負(fù)相關(guān)。3.1.3COPD肺氣虛證大鼠Th細(xì)胞變化及相關(guān)性分析 COPD肺氣虛證大鼠血清IFN-γ、IL-17、Th1/Th2升高，血清IL-4和肺組織IL-4蛋白降低，肺組織IFN-γ、IL-17蛋白表達(dá)升高。肺功能參數(shù)FEV0.3/FVC與血清IL-4呈正相關(guān)，肺泡炎積分與Th1/Th2呈正相關(guān)。肺功能參數(shù)FEV0.3與血清IFN-γ、肺組織IFN-γmRNA呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)VC與IFN-γ蛋白呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)EV0.3/FVC與Th1/Th2呈負(fù)相關(guān)，PEF與IL-17蛋白呈負(fù)相關(guān)；肺泡炎積分與IL-4蛋白呈負(fù)相關(guān)，肺病理學(xué)積分與IL-17、IFN-γ蛋白呈正相關(guān)。 3.1.4COPD肺氣虛證大鼠Treg變化及相關(guān)性分析 COPD肺氣虛證大鼠外周血CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+FoxP3+Treg降低，肺組織FoxP3蛋白表達(dá)降低。肺功能參數(shù)FEV0.3與FoxP3蛋白呈正相關(guān)，F(xiàn)VC與CD4+CD25+Treg呈正相關(guān)，F(xiàn)EV0.3/FVC與CD4+CD25+FoxP3+Treg呈正相關(guān)。肺泡炎積分與CD4+CD25+FoxP3+Treg呈負(fù)相關(guān)，肺病理學(xué)積分與FoxP3蛋白呈負(fù)相關(guān)。 3.1.5COPD肺氣虛證大鼠DC、HSP70變化及相關(guān)性分析 COPD肺氣虛證大鼠肺組織DC、HSP70陽性表達(dá)面積增加、平均光密度增強(qiáng)。肺泡炎積分、肺病理學(xué)積分分別與DC、HSP70光密度值呈正相關(guān)。肺功能參數(shù)FEV0.3與DC光密度呈負(fù)相關(guān)，PEF、FEV0.3/FVC與HSP70光密度呈負(fù)相關(guān)。 3.1.6COPD肺氣虛證大鼠MMPs/TIMPs變化及相關(guān)性分析 COPD肺氣虛證大鼠肺組織MMP-9、MMP-12呈強(qiáng)陽性表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。且肺組織MMP-9基因和蛋白表達(dá)升高，TIMP1基因和蛋白表達(dá)降低。肺功能參數(shù)FEV0.3/FVC與TIMP1蛋白呈正相關(guān)，肺泡炎積分與MMP-9光密度呈正相關(guān)，肺病理學(xué)積分與MMP-12光密度呈正相關(guān)。FEV0.3與MMP-9蛋白呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)VC與MMP-9光密度呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)EV0.3/FVC與MMP-12光密度呈負(fù)相關(guān)；呼吸頻率與TIMP1mRNA呈負(fù)相關(guān)。說明基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)的表達(dá)紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)生成增加，進(jìn)而影響COPD肺氣虛證大鼠肺組織重塑，影響肺的通氣功能，導(dǎo)致肺功能降低和肺組織損傷。 3.1.7COPD肺氣虛證大鼠JAKs/STATs變化及相關(guān)性分析 COPD肺氣虛證大鼠肺組織JAK1、STAT3mRNA表達(dá)，STAT4陽性面積率、平均光密度升高，JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)升高；STAT6陽性面積率、平均光密度較模型組降低。肺功能參數(shù)FEV0.3/FVC與STAT6呈正相關(guān)，呼吸頻率與p-STAT3蛋白呈正相關(guān)，肺泡炎積分、肺病理學(xué)積分與STAT4呈正相關(guān)。FEV0.3與p-JAK1呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)VC與STAT3mRNA呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)EV0.3/FVC與STAT3呈負(fù)相關(guān)，肺泡炎積分與STAT6、p-JAK1呈負(fù)相關(guān)。 3.1.8COPD肺氣虛證大鼠T-bet、RORγt、GATA變化及相關(guān)性分析 COPD肺氣虛證大鼠肺組織GATA-3mRNA、蛋白表達(dá)降低，T-bet、RORγtmRNA和蛋白表達(dá)升高。肺組織T-bet、RORγt蛋白和T-bet/GATA-3比值較正常組升高，GATA-3蛋白降低。肺功能參數(shù)FEV0.3與肺組織GATA-3mRNA呈正相關(guān)，呼吸頻率與RORγt蛋白呈正相關(guān)，肺泡炎積分與T-bet蛋白呈正相關(guān)，肺病理學(xué)積分與T-bet mRNA呈正相關(guān)(P0.05，P 0.01)。FEV0.3與RORγt蛋白呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)EV0.3/FVC與T-bet mRNA呈負(fù)相關(guān)，PEF與RORγtmRNA呈負(fù)相關(guān)，肺病理學(xué)積分與GATA-3蛋白呈負(fù)相關(guān)(P0.05)。 3.2六味補(bǔ)氣膠囊對COPD大鼠的防治作用 3.2.1六味補(bǔ)氣膠囊對COPD肺氣虛證大鼠呼吸系統(tǒng)的防治 與模型組比較，六味補(bǔ)氣預(yù)防和治療組大鼠蜷伏少動(dòng)，拱背蜷臥，撮毛，食量減少，毛失光澤、發(fā)黃、易脫落癥狀、體征改善，體質(zhì)量升高，呼吸頻率降低。六味補(bǔ)氣預(yù)防和治療組大鼠肺功能參數(shù)FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC升高。六味補(bǔ)氣預(yù)防和治療組大鼠氣管、支氣管有炎性細(xì)胞浸潤，但數(shù)量較模型組減少；上皮壞死、脫落；肺泡間隔破壞較少，部分肺泡擴(kuò)張成大小不等的囊泡；纖毛排列較規(guī)整。六味補(bǔ)氣預(yù)防和治療組肺系數(shù)、肺泡炎積分及病理學(xué)總積分降低。與六味補(bǔ)氣組比較，脾氨肽組FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF降低；病理學(xué)總積分比較，六味補(bǔ)氣組較脾氨肽組降低。 3.2.2六味補(bǔ)氣膠囊對COPD肺氣虛證大鼠細(xì)胞因子的防治 與模型組比較，六味補(bǔ)氣預(yù)防和治療組IL-1β、IL-6、IL-12降低；IL-10、IL-13、IL-35表達(dá)升高。與六味補(bǔ)氣組比較，脾氨肽組IL-1β、IL-6表達(dá)升高，IL-10、IL-35表達(dá)降低；金水寶組IL-12表達(dá)升高。 3.2.3六味補(bǔ)氣膠囊對COPD肺氣虛證大鼠Th細(xì)胞的防治 與模型組比較，六味補(bǔ)氣預(yù)防和治療組血清IFN-γ、IL-17、Th1/Th2表達(dá)降低，IL-4升高；肺組織IL-4mRNA、IL-4蛋白升高、IFN-γmRNA、IL-17蛋白降低。與六味補(bǔ)氣組比較，金水寶組血清IL-4降低、血清IL-17、Th1/Th2升高，脾氨肽組IFN-γ、IL-17升高。與六味補(bǔ)氣組比較，金水寶組肺組織IL-17升高；脾氨肽組肺組織IL-4蛋白降低，IFN-γ升高。 3.2.4六味補(bǔ)氣膠囊對COPD肺氣虛證大鼠Treg的防治 與模型組比較，六味補(bǔ)氣預(yù)防和治療組外周血CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+FoxP3+Treg升高，肺組織FoxP3蛋白表達(dá)升高。與六味補(bǔ)氣組比較，脾氨肽組、金水寶組CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+FoxP3+Treg表達(dá)降低；脾氨肽組FoxP3蛋白升高。 3.2.5六味補(bǔ)氣膠囊對COPD肺氣虛證大鼠DC、HSP70的防治 與模型組比較，六味補(bǔ)氣預(yù)防和治療組肺組織DC、HSP70光密度下降、陽性面積率減小。各治療組之間統(tǒng)計(jì)分析顯示，未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 3.2.6六味補(bǔ)氣膠囊對COPD肺氣虛證大鼠MMPs/TIMPs的防治 與模型組比較，六味補(bǔ)氣預(yù)防和治療組肺組織MMP-9、MMP-12表達(dá)強(qiáng)度明顯降低；TIMP1陽性表達(dá)增強(qiáng)。肺組織MMP-9基因和蛋白表達(dá)降低，TIMP1基因和蛋白表達(dá)升高。與六味補(bǔ)氣組比較，，脾氨肽組MMP-9光密度值升高，TIMP1降低；金水寶組、脾氨肽組MMP-9蛋白升高，TIMP1蛋白表達(dá)降低。 3.2.7六味補(bǔ)氣膠囊對COPD肺氣虛證大鼠JAKs/STATs的防治 與模型組比較，六味補(bǔ)氣預(yù)防和治療組肺組織STAT4陽性面積率、平均光密度降低，STAT6陽性面積率、平均光密度較模型組增大。JAK1mRNA表達(dá)及JAK1、p-JAK1、p-STAT3、STAT4蛋白蛋白表達(dá)下降；STAT6蛋白升高。與六味補(bǔ)氣組比較，金水寶組JAK1、p-JAK1蛋白升高；脾氨肽組JAK1mRNA及JAK1、p-STAT3蛋白升高；脾氨肽組STAT6蛋白升高降低。 3.2.8六味補(bǔ)氣膠囊對COPD肺氣虛證大鼠T-bet、RORγt、GATA的防治 與模型組比較，六味補(bǔ)氣預(yù)防和治療組GATA-3mRNA、蛋白表達(dá)升高，T-bet、RORγt mRNA和蛋白表達(dá)降低。與六味補(bǔ)氣組比較，金水寶組T-betmRNA和蛋白、T-bet/GATA-3、RORγt基因升高，GATA3蛋白降低；脾氨肽組T-bet蛋白、RORγt基因表達(dá)升高。 4結(jié)論 六味補(bǔ)氣膠囊防治COPD肺氣虛證大鼠的作用機(jī)制如下： 4.1改善COPD肺氣虛證大鼠呼吸系統(tǒng)癥狀體征 中藥六味補(bǔ)氣膠囊通過改善COPD肺氣虛證大鼠呼吸系統(tǒng)癥狀體征，升高肺功能參數(shù)。降低肺系數(shù)、肺泡炎積分、病理學(xué)總積分。降低肺組織炎性細(xì)胞浸潤，改善COPD肺氣虛證大鼠呼吸系統(tǒng)的癥狀體征，進(jìn)一步提高肺功能水平和改善肺組織損傷。 4.2降低COPD肺氣虛證大鼠炎癥反應(yīng) 中藥六味補(bǔ)氣膠囊能夠上調(diào)COPD肺氣虛證大鼠血清IL-10、IL-13、IL-35表達(dá)，下調(diào)IL-1β、IL-6、IL-12表達(dá)水平，降低機(jī)體炎性反應(yīng)，糾正血清細(xì)胞因子表達(dá)失衡狀態(tài)，減少炎癥介質(zhì)滲出及對肺組織器官的刺激，改善COPD肺氣虛證大鼠呼吸系統(tǒng)癥狀體征。 4.3調(diào)節(jié)COPD肺氣虛證大鼠Th細(xì)胞平衡 中藥六味補(bǔ)氣膠囊通過上調(diào)IL-4表達(dá)，下調(diào)IFN-γ、IL-17，降低Th17細(xì)胞分泌，糾正Th1/Th2細(xì)胞平衡，降低炎性細(xì)胞分泌，調(diào)整肺組織細(xì)胞及體液免疫，減輕胞膜通透性，從而改善COPD肺氣虛證大鼠呼吸系統(tǒng)癥狀體征。 4.4上調(diào)COPD肺氣虛證大鼠Treg表達(dá) 中藥六味補(bǔ)氣膠囊通過上調(diào)CD4+Treg、CD4+CD25+Treg、FoxP3mRNA及FoxP3蛋白表達(dá)，抑制CD4+CD25+Treg向CD4+CD25-T細(xì)胞進(jìn)一步分化，減少炎癥介質(zhì)的釋放，減少炎癥反應(yīng)對組織的損傷，從而改善COPD肺氣虛證大鼠呼吸系統(tǒng)癥狀體征。 4.5降低COPD肺氣虛證大鼠DC、HSP70表達(dá) 中藥六味補(bǔ)氣膠囊通過下調(diào)DC、HSP70表達(dá)，降低炎性細(xì)胞對肺組織刺激，從而改善COPD肺氣虛證大鼠呼吸系統(tǒng)癥狀體征。 4.6調(diào)節(jié)COPD肺氣虛證大鼠MMPs/TIMPs系統(tǒng) 中藥六味補(bǔ)氣膠囊通過上調(diào)TIMP1表達(dá)，下調(diào)MMP-9、MMP-12，糾正MMP-9/TIMP1平衡狀態(tài)，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，從而改善COPD肺氣虛證大鼠呼吸系統(tǒng)癥狀體征。 4.7調(diào)節(jié)COPD肺氣虛證大鼠JAKs/STATs通路表達(dá) 中藥六味補(bǔ)氣膠囊可能是通過上調(diào)STAT6表達(dá)，下調(diào)JAK1、p-JAK1、p-STAT3表達(dá)，調(diào)控JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制AKs/STATs信號(hào)通路過激活狀態(tài)，改善氣道炎癥和氣流受限癥狀，從而改善COPD肺氣虛證大鼠呼吸系統(tǒng)癥狀體征。 4.8調(diào)節(jié)COPD肺氣虛證大鼠T-bet、RORγt、GATA表達(dá) 中藥六味補(bǔ)氣膠囊可能是通過下調(diào)T-bet、RORγt表達(dá)，上調(diào)GATA-3表達(dá)，從而改善COPD肺氣虛證大鼠呼吸系統(tǒng)癥狀體征。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2361378