發(fā)布時(shí)間：2018-11-10 13:39

【摘要】：目的：本實(shí)驗(yàn)通過四血管阻斷法制備大鼠全腦缺血再灌注模型，在此基礎(chǔ)上運(yùn)用鼻咽腔降溫法對大鼠進(jìn)行頭部淺低溫，并應(yīng)用線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開放劑蒼術(shù)苷在大鼠全腦缺血前進(jìn)行側(cè)腦室注射，來觀察再灌注期間大鼠海馬MPTP的開放情況，海馬CA1區(qū)細(xì)胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)蛋白、 Bcl-2蛋白及Bax蛋白的表達(dá)。研究頭部淺低溫對全腦缺血再灌注損傷大鼠MPTP及細(xì)胞凋亡的影響,進(jìn)一步探討淺低溫腦保護(hù)的作用機(jī)制,為以后臨床治療腦缺血再灌注損傷疾病提供新的理論依據(jù)。 方法： 1實(shí)驗(yàn)分組 體重250~300g的健康雄性清結(jié)級SD大鼠72只（由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)）。將大鼠隨機(jī)分成6組（n=12）:假手術(shù)組(S組)、全腦缺血/再灌注組(IR組)、低溫組(H組)、蒼術(shù)苷組（A組）、低溫+蒼術(shù)苷組（HA組）、低溫+生理鹽水組（HN組）。 2全腦缺血再灌注模型制備 制備大鼠全腦缺血再灌注模型應(yīng)用的是改良的Pulsinelli四血管阻斷法。大鼠常規(guī)禁食8小時(shí)，無需禁水，稱重后10%水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射麻醉。麻醉成功后俯臥固定于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺,于頸后正中第一、二頸椎處剪毛消毒后切開皮膚,逐層分離，暴露雙側(cè)翼小孔。用自制電烙鐵燒灼兩側(cè)翼小孔內(nèi)椎動(dòng)脈使其永久閉塞，縫合皮膚。24h后相同方法麻醉大鼠，仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺上，氣管插管保留自主呼吸吸氧，頸前正中剪毛消毒切開皮膚，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，穿線備用。此過程中，大鼠間斷吸入七氟醚維持麻醉，尾靜脈穿刺置管持續(xù)泵入乳酸鈉林格氏液維持循環(huán)。 3實(shí)驗(yàn)處理及監(jiān)測 大鼠全腦缺血時(shí)間為15min，再灌注24h。不同組給予不同處理： S組作為假手術(shù)組只暴露雙側(cè)翼小孔，不燒灼椎動(dòng)脈；只分離頸總動(dòng)脈，不對其夾閉。其它五組都燒灼椎動(dòng)脈夾閉頸總動(dòng)脈，制成全腦缺血再灌注模型。其中，H組、HA組和HN組進(jìn)行低溫處理：在大鼠氣管插管后，咽喉部氣管插管旁置入棉球和吸痰管（低溫過程中持續(xù)吸引）以防止誤吸，雙側(cè)鼻腔置入20G硅膠管，深度約為20mm，持續(xù)泵入4-5℃的冷鹽水，速度為100ml·min-1·kg-1，實(shí)施頭部淺低溫，，等到海馬溫度降至（33.0±0.5）℃后，雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞15min，低溫維持1h后保持自然復(fù)溫。HA組和A組于再灌注前10min蒼術(shù)苷15ul左側(cè)腦室緩慢注射。HN組左側(cè)腦室注射等量生理鹽水。術(shù)中監(jiān)測腦電圖（頭皮刺入電極）、心電圖（四肢皮下刺入電極）、海馬溫度（溫度探頭置入右側(cè)海馬CA1區(qū)即前囟后3.6mm、中線右旁開3mm和皮層下2mm）以及直腸溫度(維持在37.0±0.5℃)。 4標(biāo)本制備及檢測 4.1紫分光光度儀檢測海馬MPTP開放情況 再灌注24h后，每組取6只大鼠進(jìn)行麻醉（10%水合氯醛腹腔注射），然后迅速斷頭分離出海馬組織，根據(jù)線粒體提取試劑盒說明提取海馬線粒體，整個(gè)過程均在0～4℃下完成。提出的線粒體用于MPTP開放情況的檢測。 4.2免疫組織化學(xué)法測定海馬CA1區(qū)Cyt C蛋白、Bcl-2蛋白及Bax蛋白的表達(dá) 每組取另外6只大鼠麻醉成功后，用4%多聚甲醛迅速經(jīng)心灌流固定，固定后快速斷頭取出腦組織并繼續(xù)固定于4%多聚甲醛中，然后放入4℃冰箱中保存，用于免疫組織化學(xué)檢測。 結(jié)果： 1六組大鼠體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 2大鼠海馬神經(jīng)元MPTP開放程度的比較 與S組相比，其余各組MPTP吸光值減少程度均增大，MPTP開放程度增加（P0.05）；與IR組比，H組、HA組和HN組MPTP吸光值減少程度降低，MPTP開放程度減�。≒0.05）；與H組比較，HA組MPTP吸光值減少程度增加，MPTP開放程度增加（P0.05）。 3大鼠海馬CA1區(qū)Cyt C蛋白的比較 與S組相比，其余五組Cyt C蛋白表達(dá)均增多（P0.05）；與IR組相比，H組、HN組和HA組Cyt C蛋白表達(dá)均減少（P0.05）；與H組相比，HA組Cyt C蛋白表達(dá)增多（P0.05）。H組和HN組、IR組和A組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 4大鼠海馬CA1區(qū)Bax、 Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax的比較 與S組比較，其它五組Bax蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá)均增加,H組和HN組Bcl-2/Bax比值升高,IR組和A組Bcl-2/Bax比值降低（P0.05）;與IR組比較，H組和HN組Bcl-2蛋白表達(dá)增加、Bax蛋白表達(dá)減少、Bcl-2/Bax比值升高（P0.05）；與H組和HN組比較，HA組Bcl-2蛋白表達(dá)減少、Bax蛋白表達(dá)增多、Bcl-2/Bax比值降低（P0.05）。H組和HN組比較、IR組和A組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 結(jié)論： 1頭部淺低溫可有效減輕大鼠全腦缺血再灌注損傷，抑制細(xì)胞凋亡，有神經(jīng)保護(hù)作用。 2頭部淺低溫的腦保護(hù)作用機(jī)制與抑制海馬細(xì)胞MPTP的開放有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R614

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號：2322622