【摘要】：研究背景 Sewell在1955年結扎狗冠狀動脈時,發(fā)現(xiàn)恢復血流后組織器官損傷加重。缺血再灌注損傷被首次發(fā)現(xiàn),在之后的大量動物實驗中已得到證實。肢體缺血再灌注損傷(Limb ischemia reperfusion injury-LIRI)不僅可導致局部組織損傷,還可引起遠隔臟器損傷,小腸缺血再灌注損傷還會因為細菌和毒素的釋放,誘發(fā)全身炎癥反應綜合征(SIRS),多器官功能障礙綜合征(MODS)等。目前對小腸缺血再灌注損傷的研究大都與凋亡有關。以往認為壞死和凋亡是缺血再灌注所誘導的細胞死亡的主要方式。近年來,一種新的程序性細胞死亡方式——自噬(Autophagy),即Ⅱ型程序性細胞死亡,越來越受到重視。適度的自噬是細胞完成自身代謝和細胞器更新的重要方式,對維持機體內環(huán)境穩(wěn)定,以及調控細胞損傷和老化具有重要意義；而非生理性的、過度的自噬則會導致細胞過多死亡,從而引起組織器官產生病理性變化。自噬甚至可能影響細胞凋亡的發(fā)生,自噬在小腸缺血再灌注損傷的不同階段扮演著不同角色,缺血期自噬輕度增加,具有一定的保護作用；但是在再灌注期自噬明顯增加,反而加重小腸損傷。種種跡象表明,再灌注后小腸細胞自噬異常增多可能是導致小腸結構和功能損傷的重要啟動因素之一。如果能夠早期、有效抑制自噬的發(fā)生,有望減輕小腸缺血再灌注損傷,甚至減少細胞凋亡的發(fā)生。 鹽酸戊乙奎醚注射液(長托寧)是我國自主研制的新型抗膽堿藥,具有選擇性M1、M3和N1、N2受體拮抗作用,對中樞和外周均有很強的抗膽堿作用,而對M2受體無明顯作用,可有效避免阿托品因缺乏M受體亞型選擇性所致的心動過速與阻斷突觸前膜M2受體調節(jié)功能,且藥效長而副作用較少。前期的研究表明,長托寧可抑制由缺血再灌注損傷誘發(fā)的小腸細胞凋亡,但長托寧對小腸細胞自噬的影響研究文獻報道較少。 研究目的 本實驗以肢體缺血再灌注損傷大鼠小腸為實驗研究和觀察對象,建立肢體缺血再灌注模型,以長托寧進行干預,觀察各組LDH釋放量。從而評價各組小腸組織和細胞的受損程度；熒光染色、并通過RT-PCR和Western-blot方法檢測小腸組織的自噬相關基因(autophagy-related gene, Atg)的mRNA和蛋白表達水平,從細胞和分子水平探討長托寧對肢體缺血再灌注損傷中小腸細胞自噬的影響,為臨床圍手術期小腸保護提供新的理論基礎和可能的治療方法。 研究方法和結果 本實驗主要分為二個部分,主要方法和結果如下： 一.大鼠肢體缺血再灌注損傷誘發(fā)小腸自噬的研究 1、實驗分組： 成年雄性SD大鼠48只,隨機分為2組,假手術組(S組),缺血再灌注組(LIR組),S組、LIR組組內按再灌注時間分為再灌注0h(To)、2h(T2)、4h(T4),、8h(T8)4個亞組,每亞組6只。 假手術組(S組)：成年SD大鼠,暴露股動脈后僅于股動脈表面穿過縫線,并不結扎股動脈,于相應時點取血及小腸組織,隨即處死大鼠。 缺血再灌注組(LIR組)：成年SD大鼠,分離暴露股動脈,動脈夾夾閉股動脈；再用市售橡皮筋(直徑2.5cm)環(huán)扎大鼠雙下肢近心端(壓力290-310mmHg,1mm Hg=0.133kpa)3,,再灌注0h、2h、4h、8h。于相應時點取血及小腸組織,并處死大鼠。 2、大鼠肢體缺血再灌注損傷模型的建立方法該實驗操作過程均嚴格遵循有關實驗動物保護規(guī)定,術前禁食不禁水,大鼠稱重后吸入2%-3%七氟醚淺麻醉下,將大鼠固定于試驗臺,采用文獻方法建立大鼠肢體缺血再灌注模型。具體方法：常規(guī)消毒后,切開皮膚、皮下,暴露股血管神經束,分離股動脈,動脈夾夾閉股動脈；再用市售橡皮筋(直徑2.5cm)環(huán)扎大鼠雙下肢近心端(壓力290-310mmHg,1mm Hg=0.133kpa)3h,再灌注0h、2h、4h、8h。S組暴露股動脈后在其下方放一絲線,不阻斷血流,LIR組阻斷血流。 3、大鼠肢體缺血再灌注損傷模型的鑒定 實驗分為2組,即S組和LIR組。乳酸脫氫酶漏出量可以間接反映小腸組織損傷情況,通過全自動生化分析儀檢測血清LDH釋放量等方法驗LIR的小腸損傷作用。結果發(fā)現(xiàn)LIR組大鼠T2及以后各時點血清LDH明顯高于對照組(P0.01)。說明本方法建立的肢體缺血再灌注損傷模型成功。 表明缺血再灌注損傷造成小腸細胞損傷,并可影響小腸功能。 4.大鼠肢體缺血再灌注損傷誘發(fā)小腸細胞自噬相關基因表達的研究 (1)大鼠肢體缺血再灌注損傷對小腸細胞Beclinl的mRNA表達的影響 收集各組處理后的小腸組織。采用RT-PCR方法定量檢測各組小腸細胞Beclinl的nRNA表達量。結果：LIR組小腸組織T2及以后各時點的Beclinl的mRNA相對表達量明顯高于S組(P0.01)。 說明缺血再灌注損傷可誘發(fā)小腸細胞自噬,造成小腸細胞損傷。 (2)大鼠肢體缺血再灌注損傷對小腸細胞Atg5的mRNA表達的影響 收集各組處理后的小腸組織。采用RT-PCR方法定量檢測各組小腸細胞Atg5的mRNA表達量。結果：LIR組小腸組織T2及以后各時點的Atg5的mRNA相對表達量明顯高于S組(P0.01)。 說明缺血再灌注損傷可誘發(fā)小腸細胞自噬,造成小腸細胞損傷。 (3)大鼠肢體缺血再灌注損傷對小腸細胞LC3的蛋白表達的影響 收集各組處理后的小腸組織。采用Western-blot方法定量檢測各組小腸細胞LC3的蛋白表達量。結果：LIR組小腸組織T2及以后各時點的LC3II/LC3I的相對表達量明顯高于S組(P0.01)。 說明缺血再灌注損傷可誘發(fā)小腸細胞自噬,造成小腸細胞損傷。 二.長托寧通過抑制細胞自噬減輕小腸缺血再灌注損傷 1、實驗分組：成年雄性SD大鼠48只,隨機分為2組。缺血再灌注組(LIR組),長托寧處理組(PHC組)。LIR組、PHC組組內按再灌注時間分為再灌注Oh (To)、2h(T2)、4h(T4)、8h (T8)4個亞組,每亞組大鼠6只。 缺血再灌注組(LIR組)：成年SD大鼠,分離暴露股動脈,動脈夾夾閉股動脈；再用市售橡皮筋(直徑2.5cm)環(huán)扎大鼠雙下肢近心端(壓力290-310mmHg,1mm Hg=0.133kpa)3h,再灌注Oh、2h、4h、8h。分別于再灌注開放前10min由尾靜脈給予相同劑量的生理鹽水,于相應時點處死大鼠,取血及小腸組織。 長托寧處理組(PHC組)：成年SD大鼠,分離暴露股動脈,動脈夾夾閉股動脈；再用市售橡皮筋(直徑2.5cm)環(huán)扎大鼠雙下肢近心端(壓力290-310mmHg,1mm Hg=0.133kpa)3h,再灌注0h,2h,4h,8h。分別于再灌注開放前15min由尾靜脈給予0.15mg.kg-1的長托寧,于相應時點處死大鼠,取血及小腸組織。 2、大鼠肢體缺血再灌注損傷模型的建立方法：同第一部分。 3、大鼠肢體缺血再灌注損傷模型的鑒定 實驗分為2組,LIR組和PHC組。通過全自動生化分析儀檢測血清LDH釋放量等方法驗證肢體缺血再灌注的小腸損傷作用。結果發(fā)現(xiàn)PHC組大鼠T2及以后各時點血清LDH明顯低于LIR組(P0.01)。說明本方法建立的肢體缺血再灌注損傷模型成功。也說明長托寧可減輕由缺血再灌注損傷誘導的小腸損傷。 4.長托寧對小腸細胞自噬相關基因表達的研究 (1)長托寧對小腸細胞Beclinl的mRNA表達的影響 收集各組處理后的小腸組織。采用RT-PCR方法定量檢測各組小腸細胞Beclinl的mRNA表達量。結果：PHC組小腸組織T2以后時點的Beclinl的mRNA相對表達量明顯低于LIR組(P0.01)。 說明長托寧可抑制由缺血再灌注損傷誘導的小腸細胞自噬,減輕小腸組織損傷。 (2)長托寧對小腸細胞Atg5的mRNA表達的影響 收集各組處理后的小腸組織。采用RT-PCR方法定量檢測各組小腸細胞Atg5的mRNA表達量。結果：PHC組小腸組織T2及以后時點的Atg5的mRNA相對表達量明顯低于LIR組(P.01)。 說明長托寧可抑制由缺血再灌注損傷誘導的小腸細胞自噬,減輕小腸組織損傷。 (3)長托寧對小腸細胞LC3的蛋白表達的影響 收集各組處理后的小腸組織。采用Western-blot方法定量檢測各組小腸細胞LC3的蛋白表達量。結果：PHC組小腸組織T2以后時點的LC3II/LC3I蛋白相對表達量明顯低于LIR組(P0.01) 說明長托寧可抑制由缺血再灌注損傷誘導的小腸細胞自噬,減輕小腸組織損傷。 主要結論 研究應用成年SD大鼠,成功建立肢體缺血再灌注損傷的模型,以長托寧進行干預,觀察長托寧對缺血再灌注小腸細胞自噬及自噬相關基因表達的影響,以闡明長托寧通過抑制自噬減輕小腸細胞缺血再灌注損傷及其機制。 主要結論如下： 1.本研究應用肢體缺血再灌注損傷的模型在導致小腸組織損傷方面可達到滿意效果。 2.肢體缺血再灌注損傷可誘發(fā)小腸細胞自噬。 3.長托寧可抑制由肢體缺血再灌注損傷誘發(fā)的小腸細胞自噬。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R614

【參考文獻】

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1 許鐵;龐濤;縱雪梅;梁高永;王志萍;耿德勤;燕憲亮;王厚清;;鹽酸戊乙奎醚對大鼠腦缺血-再灌流損傷的保護作用[J];中華急診醫(yī)學雜志;2007年09期

2 朱安祥;;鹽酸戊乙奎醚抗缺血再灌注損傷的作用[J];臨床薈萃;2012年12期

3 冷玉芳;張悅;薛興;張艷;汪濤;康于慶;;鹽酸戊乙奎醚后處理對肢體缺血-再灌注大鼠肝損傷的影響[J];臨床麻醉學雜志;2012年09期

4 邱冬梅;陳莉;;細胞自噬:病理學研究的新熱點[J];臨床與實驗病理學雜志;2012年03期

5 何韜;王海杰;譚玉珍;;自噬在細胞存活和死亡中的作用[J];生理科學進展;2008年01期

6 牛文忠,高占國,趙德祿,劉傳繢;3-(2-羥基-2-環(huán)戊基-2-苯基-乙氧基)奎寧環(huán)烷及其光學異構體與外周毒蕈堿性受體的結合特性(英文)[J];中國藥理學與毒理學雜志;1999年01期

7 ;Molecular mechanism and regulation of autophagy[J];Acta Pharmacologica Sinica;2005年12期

8 ;Effects of penehyclidine hydrochloride in small intestinal damage caused by limb ischemia-reperfusion[J];World Journal of Gastroenterology;2011年02期

9 董振香,單平,顧元健;長托寧[J];中國新藥雜志;2004年06期

10 蔣志平;夏中元;張蕾;孟慶濤;李文瀾;吳迪;賈一帆;侯家保;;鹽酸戊乙奎醚對失血性休克大鼠腸黏膜的保護作用[J];中國醫(yī)藥導報;2012年31期

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本文編號：2304534