【摘要】：研究背景 心房顫動(房顫AF)是指心房活動不協(xié)調(diào),導(dǎo)致規(guī)則有序的心房電機(jī)械功能惡化,在心電圖上的表現(xiàn)為P波消失,代之以不規(guī)則的基線波動,心室率極不規(guī)則,是最嚴(yán)重的心房電活動紊亂之一,具有較高的致病率、致殘率,并導(dǎo)致了沉重的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。無序的顫動使心房泵血功能喪失或惡化,加之房室結(jié)對快速無序的心房激動的遞減傳導(dǎo),可引起心室極不規(guī)則的興奮,心房收縮力喪失,血流瘀滯易形成栓子。因此心功能受損、心室率(律)紊亂、心房附壁血栓形成等是AF患者的主要病理生理特點(diǎn)。過去很多實(shí)驗(yàn)室或臨床研究已經(jīng)表明,心房電重構(gòu)(ER)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)(SR)是發(fā)生AF的兩大主要機(jī)制。心房ER主要包括心房有效不應(yīng)期(AERP)及動作電位時(shí)程的縮短,動作電位傳導(dǎo)速度減慢,是AF或快速心房率所產(chǎn)生的有利于AF維持和發(fā)生的心房電生理特性的改變。ER發(fā)生在AF過程的較早期,而SR發(fā)生的相對較晚。近來對編碼特異離子通道蛋白基因的mRNA表達(dá)異常的研究引起了越來越多的關(guān)注,它可以引起離子通道蛋白數(shù)量、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)的改變,尤其是鉀離子通道,從而成為ER和心律失常的潛在分子機(jī)制。其中轉(zhuǎn)錄后水平對mRNA的調(diào)節(jié)也成為了人們關(guān)注的焦點(diǎn)。目前藥物依然是AF治療的重要方法,藥物能恢復(fù)和維持竇性心律,控制心室率。但是藥物治療的副作用較多如惡心、頭暈、疲勞甚至室性心律失常。AF的非藥物治療包括電轉(zhuǎn)復(fù)、射頻消融治療和外科迷宮手術(shù)治療。電復(fù)律是指用兩個(gè)電極片放置在病人胸部的適當(dāng)部位,通過除顫儀發(fā)放電流,重新恢復(fù)竇性心律的方法。電復(fù)律不是一種根治AF的方法,AF往往會復(fù)發(fā),而且部分患者仍需要繼續(xù)服用抗心律失常藥物維持竇性心律。導(dǎo)管消融治療及外科迷宮手術(shù)都屬于有創(chuàng)治療,易并發(fā)感染及血栓形成等。因此,要找到一個(gè)高效、安全的新策略用于治療AF是非常重要的。 MicroRNA(miRNA)是小RNA中的一個(gè)大家族,最早是Lee等人在線蟲中發(fā)現(xiàn),其在果蠅、植物和哺乳動物等真核生物中均有所發(fā)現(xiàn)。因?yàn)樗趧又参矬w內(nèi)發(fā)揮著重要且廣泛的調(diào)控作用,日漸成為人們新的研究熱點(diǎn)。miRNA為一類內(nèi)源性非編碼的單鏈小RNA,通過與其5’端“種子序列”與目的基因mRNA的3’非翻譯區(qū)完全或不完全性互補(bǔ)配對,對目的基因mRNA的堿基進(jìn)行切割或抑制翻譯,指導(dǎo)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)來調(diào)節(jié)目的基因表達(dá),介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控。新進(jìn)的研究表明miRNA不僅調(diào)控發(fā)育,而且在造血、細(xì)胞增殖和死亡等方面發(fā)揮作用,另外對心肌肥厚、心力衰竭、動脈粥樣硬化和心律失常等心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展有重要的影響。 MiRNA作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要環(huán)節(jié),可以對編碼特異離子通道蛋白基因的mRNA表達(dá)產(chǎn)生影響,進(jìn)而使離子通道蛋白及連接蛋白過度表達(dá)或低表達(dá),致使離子通道平衡失調(diào),誘發(fā)心律失常。miRNA的表達(dá)具有組織特異性,如在心肌富含miR-1,let-7,miR-133,miR-126-3p,miR-30c,而動脈平滑肌富含miR-145, let-7,miR-125b,miR-125a,miR-23和miR-143,但miR-1與miR-133在其中也有表達(dá)。miR-1與miR-133被認(rèn)為是肌肉特異性miRNA,在成人的心臟及骨骼肌中優(yōu)先表達(dá)�，F(xiàn)在的研究認(rèn)為miR-1在許多心臟疾病中扮演重要角色,特別是心律失常的病理生理過程。Yang等研究發(fā)現(xiàn)：梗死小鼠心臟內(nèi)過量表達(dá)miR-1可以導(dǎo)致心律失常。miR-1通過作用于基因GJA1和KCNJ2減少心肌Cx43,Kir2.1蛋白的表達(dá),使減慢傳導(dǎo),降低了心肌內(nèi)向整流鉀離子電流(IKl),導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化,促使發(fā)生快速性心律失常,心電圖中表現(xiàn)為QRS波增寬,QT間期延長。而miR-1通過反義寡核苷酸(AMO-1)被移除后,心律失常的發(fā)生明顯減少。由此可知miR-1通過引起心肌缺血時(shí)離子通道失衡而達(dá)到其致心律失常作用。近來在Terentyev等人的研究中發(fā)現(xiàn)miR-1還可以通過調(diào)節(jié)鈣離子流來參與心律失常的發(fā)生。因此,miR-1被認(rèn)為是治療心律失常的新靶點(diǎn)。 雖然miR-1在心律失常病理生理過程中的作用已經(jīng)有所研究,但是miR-1在AF早期ER中所發(fā)揮的機(jī)制至今還沒有報(bào)道。目前miRNA-1在體轉(zhuǎn)染的研究中大部分選小鼠為動物模型,轉(zhuǎn)染后將心肌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),檢測其對應(yīng)的離子通道蛋白含量的變化,但在大型動物模型中進(jìn)行miRNA-1在體轉(zhuǎn)染的研究較為少見,而大型動物如犬、兔等AF的發(fā)生發(fā)展過程更接近于人類,且在體轉(zhuǎn)染miRNA對動物模型AF的維持與誘發(fā)等觀察更直接,因此,我們選擇新西蘭大白兔做為AF模型來探討相關(guān)miRNA-1的參與機(jī)制,有助于我們更好理解人類AF發(fā)生的機(jī)制。雖然新西蘭大白兔的miRNA序列還沒有納入miRbase數(shù)據(jù)庫中,但我們在Ensembl數(shù)據(jù)庫(http://asia.ensembl.org/Oryctolagus_cuniculus/Info/Index)中找到新西蘭大白兔的基因序列草圖,可用軟件分析出其miR-1的序列。據(jù)此,本課題組擬以快速心房起搏兔為研究模型,以miR-1為候選miRNA,活體心房內(nèi)注射轉(zhuǎn)染miR-1及AMO-1,檢測miR-1在快速心房起搏兔模型心房肌中的表達(dá)及鉀離子通道蛋白含量及其編碼mRNA的變化,以闡明miR-1參與AF的發(fā)展與維持,為AF的治療提供新的靶點(diǎn)。 研究目的 1.評價(jià)miR-1在快速起搏1周后在兔心房肌中表達(dá)水平的變化； 2.明確miR-1的異常表達(dá)與快速起搏兔心房早期ER的關(guān)系； 3.探究miR-1促進(jìn)心房早期ER的潛在分子機(jī)制。 材料和方法 1.動物模型建立 1.1動物分組 選購健康新西蘭大白兔24只,雌雄不拘,體重1.5-2.5kg,隨機(jī)分為4組,各組6只。其中第1組設(shè)為假手術(shù),第2組設(shè)為快速起搏組,第3組設(shè)為起搏+miRNA-1轉(zhuǎn)染組,第4組設(shè)為起搏+AMO-1轉(zhuǎn)染組。 ①假手術(shù)(第1組,n=6),埋置起搏器不予起搏,1周后開胸,右房(RA)心肌內(nèi)注射對照病毒,1周后處死； ②心房快速起搏組(第2組,n=6),埋置起搏器以起搏頻率600bpm連續(xù)起搏1周。開胸,RA心肌內(nèi)注射對照病毒,1周后處死； ③心房快速起搏+miR-1轉(zhuǎn)染組(第3組,n=6),埋置起搏器以起搏頻率600bpm連續(xù)起搏1周。開胸,RA心肌內(nèi)注射miR-1,1周后處死； ④心房快速起搏+miR-1轉(zhuǎn)染組(第4組,n=6),埋置起搏器以起搏頻率600bpm連續(xù)起搏1周。開胸,RA心肌內(nèi)注射AMO-1,1周后處死。 1.2快速心房起搏模型建立 先用3%戊(苯)巴比妥鈉(30-35mg/kg)經(jīng)耳緣靜脈將新西蘭大白兔麻醉,繼以氟烷(2-3%)及一氧化二氮(60-75%)維持麻醉狀態(tài)(28),仰臥位固定動物,氣管插管,呼吸機(jī)機(jī)械通氣,調(diào)節(jié)呼吸頻率30-50bpm,每分通氣量15-40ml,吸呼比為2：1。胸頸部用利多卡因局麻并脫毛、常規(guī)消毒、鋪巾,切開右頸部皮膚、分離皮下組織,暴露右頸內(nèi)靜脈,送入“J”形心房單電極,在X線透視下將電極頭端固定于右心耳,整個(gè)過程都遵守?zé)o菌操作。 2.電生理指標(biāo)檢測 電生理檢查通過多通道程序刺激儀分別于起搏前、轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染1周三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行,并由電生理記錄系統(tǒng)記錄下RA心內(nèi)心電圖。AERP的測定采用S1S2反向掃描刺激法,S1S2呈8：1,步長5ms,基礎(chǔ)起搏刺激周長分別為150、130ms,AERP定義為S2不引起心房激動的最長S1S2間期。AF由S1S2程序刺激或者burst刺激誘發(fā)。 3.構(gòu)建和生產(chǎn)慢病毒 新西蘭大白兔miR-1和AMO-1的前體序列由TELEBIO公司構(gòu)建,慢病毒滴度為1×109TU/ml。 4.在體基因轉(zhuǎn)染 在快速起搏1周后,右胸第4肋間打開胸腔,充分暴露心臟并剝離心包,將慢病毒復(fù)合物多點(diǎn)斜行注射到快速心房起搏兔RA前壁,關(guān)胸。一周后處死,立即取出心臟用PBS液由主動脈根部逆行灌注,然后分離出RA,拭干后保存在-80。C有待下一步使用。 5.實(shí)時(shí)定量RT-PCR 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)檢測miR-1和KCNE1/KCNB2mRNA表達(dá)水平。 6. Western blot檢測 Western blot檢測KCNE1和KCNB2所編碼的離子通道蛋白表達(dá)水平。 7.熒光素梅報(bào)告分析 通過熒光素梅報(bào)告分析證實(shí)KCNE1和KCNB2是miR-1的靶基因。 結(jié)果 1.在快速起搏1周后,兔RA可發(fā)現(xiàn)早期ER； 2.在快速起搏1周后,miR-1的表達(dá)水平發(fā)生上調(diào)； 3.通過轉(zhuǎn)染外源基因使miR-1過表達(dá),促進(jìn)了心房ER的發(fā)生,應(yīng)用AMO-1拮抗miR-1后可逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象； 4. KCNE1和KCNB2是miR-1的靶基因,他們的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。 結(jié)論 MiR-1通過作用于其靶基因KCNE1和KCNB2來調(diào)節(jié)后者編碼的鉀離子通道蛋白,從而影響心臟鉀離子通道及電流,參與了由快速起搏引起的早期心房ER,表明miR-1可能在AF的發(fā)生過程中起到重要的作用。因此,miR-1作為治療AF的潛在靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。 創(chuàng)新性 1.用新西蘭大白兔制作快速心房起搏動物模型并檢測miR-1在心房細(xì)胞中的表達(dá)變化； 2.心房肌內(nèi)活體注射miR-1及AMO-11周后體外檢測離子通道蛋白及其編碼基因的變化,探討miR-1對鉀離子通道及心房ER的影響及意義。 局限性 1.迄今為止,已有數(shù)千個(gè)microRNA分子先后在生物體內(nèi)被鑒定,我們只進(jìn)行了miR-1對心房早期ER的研究。 2.同一種miRNA在不同的AF類型或在AF的不同時(shí)期發(fā)揮作用的不盡相同,我們只研究了miR-1對快速起搏兔右心房早期ER的影響。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R541.75

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號：2303525