【摘要】：目的:本實驗利用乙醇誘導(dǎo)體外人肝細胞(L-02)損傷模型,進一步驗證“葛黃顆粒”防治酒精性肝病的作用;研究其對乙醇誘導(dǎo)的L-02細胞氧化應(yīng)激損傷中線粒體功能的保護作用,進一步闡明葛黃顆粒防治酒精性肝病的作用機制。方法:1.含藥血清的制備:雄性SD大鼠60只,體重180-220g,隨機分為3個組,每組20只,分別為空白對照組、葛黃顆粒組(3.1g生藥/100g體重/天)、美他多辛組(0.1g/100g體重/天),每日早、晚各灌胃1次(1ml/100g/次),連續(xù)5天。末次給藥前12h禁食不禁水,于末次給藥后1h,2%戊巴比妥鈉(0.3ml/100g)麻醉動物,腹主動脈采血制備含藥血清。2.在體外L-02細胞中,分別加入不同體積比(5%、2.5%、1.25%)的葛黃顆粒含藥血清及不同體積比的(5%、2.5%、1.25%)陽性對照藥美他多辛含藥血清,利用CCK8法檢測細胞活力,觀察含藥血清對L-02細胞活力的影響。3.選取乙醇終濃度為0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、5%分別作用于L-02細胞6h、12h、24h進行造模。采用CCK8法檢測細胞活力篩選出最佳乙醇濃度作用范圍,同時用全自動生化分析儀檢測細胞上清液AST、LDH酶活力,結(jié)合CCK8結(jié)果,以確定造模時間及造模的乙醇濃度。3、以3%的乙醇濃度誘導(dǎo)損傷L-02細胞24h,然后以不同體積比(5%、2.5%、1.25%)的葛黃顆粒含藥血清(即分為GHG5%組、GHG2.5%組、GHG1.25%組)及5%體積比的美他多辛含藥血清(即陽性對照組)培養(yǎng)L-02細胞6h、12h、24h,收集細胞培養(yǎng)上清液。利用全自動生化分析儀檢測細胞上清液AST、LDH酶活力,驗證葛黃顆粒含藥血清保肝、降酶的作用,同時篩選出葛黃顆粒含藥血清的最佳作用濃度及時間為后續(xù)實驗所用。4、據(jù)2、3中所得結(jié)果,以3%的乙醇濃度誘導(dǎo)損傷L-02細胞24h后,以5%體積比的葛黃顆粒含藥血清及5%體積比的美他多辛含藥血清培養(yǎng)L-02細胞24h后收集細胞,利用硫代巴比妥酸法、黃嘌呤氧化酶法及賴氏法測定L-02細胞中丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)的活力,利用流式細胞儀檢測細胞活性氧(ROS)水平、JC-1法檢測線粒體膜電位(MMP)水平,全自動酶標(biāo)儀檢測三磷酸腺苷(ATP)含量來闡明其對乙醇誘導(dǎo)的L-02細胞氧化應(yīng)激損傷中線粒體功能的保護作用。結(jié)果:1.分別以3.1g生藥/100g體重/天及美他多辛0.1g/100g體重/天給大鼠灌胃,制備葛黃顆粒及美他多辛含藥血清。不同濃度的葛黃顆粒含藥血清及美他多辛含藥血清分別作用于L-02細胞24h,各組細胞活力無顯著改變(P0.05)。2.當(dāng)乙醇濃度低于1.0%時,各作用時間點的細胞活力均大于對照組(P0.05),顯微鏡下觀察細胞形態(tài)無明顯改變。當(dāng)乙醇濃度在1.5%-3.0%時,細胞活力隨著乙醇濃度的增加及作用時間的延長呈逐漸減弱趨勢,但均在75%以上(P0.05),顯微鏡下觀察細胞數(shù)較正常組有所減少,部分呈圓形,體積稍增大,少數(shù)細胞結(jié)構(gòu)不清,可見到核融解和核膜破裂,漂浮細胞增多;當(dāng)乙醇濃度為5%時,細胞活力明顯減弱(P0.05),顯微鏡下觀察細胞數(shù)較正常組明顯稀少,大部分呈圓形,體積明顯增大,細胞結(jié)構(gòu)不清,并出現(xiàn)大量核融解和核膜破裂現(xiàn)象,漂浮細胞明顯增多;當(dāng)乙醇濃度為2.5%、3%、5%時,干預(yù)24h后AST、LDH含量明顯升高(P0.05)。最終選取3%乙醇濃度作用L-02細胞24h建立酒精性L-02細胞損傷模型以完成后續(xù)實驗。3.含藥血清作用6h后對細胞上清液中AST、LDH的含量無明顯變化,在作用12h后5%體積比葛黃顆粒、美他多辛含藥血清組細胞上清液中AST、LDH的含量有所下降(P0.05);在作用24h后2.5%體積比葛黃顆粒、美他多辛含藥血清組細胞上清液中AST、LDH的含量有所下降(P0.05),5%體積比葛黃顆粒、美他多辛含藥血清組細胞上清液中AST、LDH的含量明顯下降(P0.05),兩組間無顯著差異(P0.05)。因此,在后續(xù)實驗中選取5%作為葛黃顆粒含藥血清最佳作用濃度,24h為最佳作用時間。4.與正常對照組比較,模型組的SOD、GSH-Px酶活力均顯著降低(P0.05);MDA含量均顯著升高(P0.05);與模型組比較,GHG5%組及陽性對照組GSH-Px酶活力均顯著升高(P0.05),MDA含量均顯著降低(P0.05)。5.與正常對照組比較,模型組的ROS水平顯著升高(P0.05),MMP水平明顯降低(P0.05),ATP含量明顯減少(P0.05);與模型組比較,GHG5%組及陽性對照組ROS水平顯著降低(P0.05),MMP水平明顯升高(P0.05),ATP含量明顯增多(P0.05)。結(jié)論:1.葛黃顆粒含藥血清對正常L-02細胞生長無明顯影響;2.乙醇影響培養(yǎng)L-02細胞活力,誘導(dǎo)細胞死亡;3.葛黃顆粒含藥血清抑制乙醇誘導(dǎo)的L-02細胞AST、LDH泄漏,降低細胞中MDA、ROS含量,增加胞內(nèi)SOD、GSH-Px活力,提高線粒體膜電位,增加胞內(nèi)ATP含量,提示其可能通過調(diào)整細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平和保護線粒體功能而起到解酒、保肝、降酶作用。這些研究結(jié)果為葛黃顆粒的新藥開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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本文編號：2276769