【摘要】：研究背景： 心肌梗死(myocardial infarction, MI)是心血管疾病致死及致殘的主要原因。我國每年約百萬余患者死于急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI),該病被視為“人類健康第一殺手”。近年來隨著溶栓、心臟介入手術(shù)的廣泛開展及藥物治療在心肌梗死治療中的迅猛發(fā)展,有效地挽救了心肌梗死患者瀕臨死亡的心肌,預(yù)后得到了極大改善,但仍有許多患者由于各種原因未能及時(shí)地進(jìn)行血運(yùn)重建,心肌發(fā)生了不可逆的死亡,引起心室重構(gòu)(ventricular remodeling, VR)。 心室重構(gòu)是指心肌梗死后由神經(jīng)體液調(diào)節(jié)機(jī)制激活、炎癥、細(xì)胞因子引起心肌細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變,使心臟結(jié)構(gòu)功能按照一定的模式進(jìn)行重塑,發(fā)生的左心室的進(jìn)行性擴(kuò)張和外形改變,包括心室容積、形狀、室壁厚度、心肌結(jié)構(gòu)等方面的改變,導(dǎo)致心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)和血流動(dòng)力學(xué)異常,左室進(jìn)行性擴(kuò)大,收縮功能逐漸降低,最終導(dǎo)致心力衰竭(heart failure, HF)和死亡。心室重構(gòu)與急性心肌梗死早期心臟破裂、室壁瘤形成等嚴(yán)重并發(fā)癥有關(guān),是影響心肌梗死近、晚期預(yù)后的主要原因。心肌梗死的嚴(yán)重程度不僅取決于梗死面積大小,其與炎癥細(xì)胞的浸潤及炎癥細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)也密切相關(guān)；而梗死心肌的重構(gòu)也與梗死面積、梗死后炎癥反應(yīng)及梗死心肌的修復(fù)密切相關(guān)。 心肌梗死后的修復(fù)過程中存在生理性和病理性免疫炎癥反應(yīng),生理性的炎癥反應(yīng)促進(jìn)了自身修復(fù)和保護(hù),病理性免疫炎癥反應(yīng)則介導(dǎo)了心室重構(gòu)和心力衰竭的發(fā)生。梗死心肌的修復(fù)有賴于炎癥介質(zhì)的釋放及白細(xì)胞介導(dǎo)的壞死細(xì)胞及細(xì)胞碎片的清除,免疫反應(yīng)在整個(gè)修復(fù)過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,其具體機(jī)制尚未完全明確。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),通過適時(shí)的調(diào)控免疫細(xì)胞、炎癥因子的表達(dá),抑制免疫炎癥反應(yīng),可以在一定程度上改善心肌的重構(gòu),減少了心力衰竭的發(fā)生。因此,心室重構(gòu)中免疫調(diào)節(jié)機(jī)制可能成為心室重構(gòu)相關(guān)疾病治療的新靶點(diǎn),有效地控制心肌梗死后的炎癥反應(yīng),可能是延緩、逆轉(zhuǎn)心肌梗死后心室重構(gòu)及預(yù)防心力衰竭的關(guān)鍵所在。 姜黃素(Curcumin)是姜黃(Curcuma)中提取的酚類物質(zhì),目前己經(jīng)有研究表明,姜黃素對心肌的缺血性再灌注損傷具有保護(hù)作用,且這種作用呈一定的劑量依賴關(guān)系；姜黃素還可抑制左室壓力超負(fù)荷導(dǎo)致的不良心室重構(gòu),改善左室功能；在大鼠心肌梗死中,姜黃素改善心功能的作用也被多次證實(shí)。但姜黃素心肌保護(hù)作用的作用仍不明確。 姜黃素的藥理作用廣泛,其在免疫調(diào)控方面的功效也備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),姜黃素可調(diào)節(jié)促炎與抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)、抑制4F-κB信號(hào)通路活化、清除氧自由基以及抑制細(xì)胞凋亡等,有效地降低血液循環(huán)中白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-12(IL-12)、TNF-α水平,同時(shí)還可抑制轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長因子(TGF-β)和白介素-10(IL-10)的升高,這些研究結(jié)果提示姜黃素具有雙向免疫調(diào)控作用,促使機(jī)體的炎癥反應(yīng)處于一種低水平的平衡狀態(tài),避免組織過度的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的機(jī)體損傷。 基于對心肌梗死后心室重構(gòu)中炎癥反應(yīng)過程的理解和姜黃素對炎癥性疾病及改善心功能的療效,我們推斷姜黃素可能通過免疫調(diào)控抑制心肌梗死后的炎癥反應(yīng),從而發(fā)揮抗心室重構(gòu)的作用。本研究分為兩部分：在第一部分研究中,我們通過結(jié)扎小鼠冠狀動(dòng)脈前降支來制備心肌梗死的動(dòng)物模型,通過觀測不同劑量姜黃素對心肌梗死后4周小鼠心臟功能及結(jié)構(gòu)、心肌組織病理學(xué)、心肌膠原重構(gòu)以及心肌細(xì)胞凋亡的影響,并設(shè)定陽性對照組,以明確姜黃素在改善心肌梗死后心功能方面的確切療效；第二部分研究,我們通過檢測姜黃素對梗死心肌組織炎癥反應(yīng)的影響,旨在闡明姜黃素改善心肌梗死后心功能可能存在的免疫調(diào)控機(jī)制,為心肌梗死后心室重構(gòu)的預(yù)防和臨床救治提供新的思路。 第一部分姜黃素對小鼠心肌梗死后心功能及心室重構(gòu)的影響 目的： 探討姜黃素對心肌梗死后小鼠心功能及心室重構(gòu)的影響。 方法： 1.小鼠心肌梗死模型的制備與分組 選用SPF級雄性C57BL/6小鼠,周齡為8-10周,體重20-25g,結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支建立心肌梗死模型。開胸結(jié)扎前降支,觀測結(jié)扎部位以下心肌顏色變蒼白,心電圖顯示心肌有缺血表現(xiàn),即證明造模成功。將心肌梗死模型成功的小鼠隨機(jī)分為4組：模型對照組,依那普利組,姜黃素低劑量組,姜黃素高劑量組；假手術(shù)組為開胸后冠狀動(dòng)脈前降支只穿線,不結(jié)扎。本部分研究共5組：Sham、MI組分別給予6%乙醇和6%聚乙醇400混合液1ml/kg.d,腹腔注射；依那普利組(陽性對照組)：依那普利劑量為7.5mg/kg.d,研磨后用蒸餾水溶解后灌胃,并予以6%乙醇和6%聚乙二醇400混合液4ml/kg.d腹腔注射；姜黃素低、高劑量組分別給予姜黃素溶液4ml/kg.d(兩組藥物濃度分別為12.5mg/ml、25mg/ml),腹腔注射。各組小鼠均正常飲食飲水,連續(xù)給藥4周。 2.超聲心動(dòng)圖評價(jià)心肌梗死后小鼠心功能 于術(shù)后4周檢測超聲心動(dòng)圖,探頭頻率為30MHz。采集胸骨旁長軸切面、心尖四腔切面B-Mode圖像。取胸骨旁左室短軸,2D超聲示左室短軸切面,在乳頭肌水平應(yīng)用M型超聲記錄左心室運(yùn)動(dòng)情況。形態(tài)學(xué)指標(biāo)包括：左室舒張末期內(nèi)徑(]VEDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESd),收縮功能指標(biāo)包括：射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、短軸收縮率(-VFS)。比較各組小鼠心臟形態(tài)及功能變化。 3.體重、心臟重量/體重比測定及心臟大體形態(tài)學(xué)觀察 小鼠測過超聲后,稱量并記錄各組小鼠體重,用1%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔麻醉后,于左胸觸及心尖搏動(dòng)處用1ml注射器抽取血液1ml左右,加入抗凝管中,靜置2h后,離心(2000r/min,15min)后取上層清液,放入-20℃冰箱待檢。心臟采血后處死小鼠,迅速開胸,剪下心臟,迅速放入冰生理鹽水中,洗盡血液,肉眼觀察心臟大體形態(tài),剪除左、右心耳及殘余大血管后以濾紙濾干,電子天平稱量心臟實(shí)際重量(濕重),并計(jì)算其與體重的比值。取出心臟稱重后直接放入-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)渥鲂募〗Y(jié)締組織染色。組織染色準(zhǔn)備時(shí),將心臟從超低溫冰箱中取出后沿著結(jié)扎線,并垂直于心臟的長軸將心臟剪成兩半,留取心臟結(jié)扎線至心尖的那一部分,置于4%的福爾馬林溶液中固定保存,用于免疫組織化學(xué)研究。 4.小鼠心肌結(jié)締組織染色 4周后處死小鼠,小鼠心肌組織用HE染色和Masson三色染色法進(jìn)行組織病理學(xué)觀察；免疫組化法檢測心肌組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的蛋白表達(dá)。 5.姜黃素對心肌梗死小鼠梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色檢測心肌梗死梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞凋亡,比較各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況。 6.數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA).方差齊時(shí),組間多重比較則采用LSD法；若方差不齊則采用Welch穩(wěn)健估計(jì),組間多重比較則采用Dunnett's T3法。P0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.小鼠心臟超聲觀察結(jié)果 結(jié)果顯示：各組間彩色多普勒超聲心動(dòng)圖心功能指標(biāo)LVEDd、LVESd、LVEF、 LVFS差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。與假手術(shù)組相比,模型對照組、姜黃素高低劑量組及依那普利組小鼠心功能指標(biāo)LVEDd、LVESd顯著升高(P0.01),LVEF、LVFS顯著降低(P0.01)。與模型對照組比較,依那普利組及姜黃素高、低劑量組LVEDd、LVESd均顯著降低,而LVEF、LVFS顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),說明姜黃素、依那普利均能有效改善心功能,減少左室擴(kuò)張。與依那普利組相比,姜黃素低劑量組LVFS降低、LVEF有所降低(P0.01),說明姜黃素低劑量組改善心功能方面不及依那普利組顯著；與依那普利組比較,姜黃素高劑量組LVESd有所降低(P0.01)、FS有所升高(P0.01),說明姜黃素高劑量組較依那普利在改善心功能方面可能存在更好的療效。與姜黃素低劑量組比較,姜黃素高劑量組LVEDd、LVESd降低,而LVEF、LVFS明顯升高(P0.01)。以上說明,在改善心梗后小鼠心功能方面,姜黃素高劑量組療效優(yōu)于姜黃素低劑量組,與依那普利效果相當(dāng)。 2.小鼠心肌梗死后體重、心臟重量及心臟重量/體重比結(jié)果 結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比,模型對照組小鼠心臟重量、心臟重量/體重比明顯升高,體重明顯減輕,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),說明冠脈結(jié)扎所致的心肌梗死后心室發(fā)生重構(gòu),心臟重量增加；與心梗模型比較,依那普利組、姜黃素高、低劑量組的心臟重量、心臟重量/體重比降低明顯,體重增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),說明依那普利和姜黃素干預(yù)均可以改善心肌梗死后不良心室重構(gòu)；依那普利組、姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組在心臟重量、心臟重量/體重比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),說明依那普利和姜黃素能明顯緩解心室肥厚,效果無明顯差異。 3.小鼠心臟大體形態(tài)觀察 結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較,模型對照組小鼠心臟體積明顯增大,左心室室腔明顯擴(kuò)大,心臟已不能維持正常幾何形狀；與模型對照組比較,姜黃素低、高劑量組心臟基本能維持正常幾何形狀,體積縮小,梗死區(qū)面積縮小,梗死區(qū)仍殘存心肌組織,彈性及韌性較好；心室腔擴(kuò)張程度減輕,且與依那普利組差異不明顯。 4.HE染色結(jié)果 假手術(shù)組心肌著色均勻,橫紋排列整齊,細(xì)胞界限清晰,排列規(guī)整,顯示正常心肌細(xì)胞形態(tài)。模型對照組心肌纖維增粗、變長、排列紊亂、間隙增寬,細(xì)胞核大而深染,可見炎癥細(xì)胞浸潤。姜黃素高、低劑量組與依那普利組邊緣區(qū)見少量心肌細(xì)胞肥大增生,有點(diǎn)狀纖維增生,非梗死區(qū)心肌細(xì)胞排列整齊,炎癥細(xì)胞浸潤較模型對照組減輕。其中姜黃素高劑量組與依那普利組其纖維增生程度較姜黃素低劑量組減弱明顯,炎性細(xì)胞浸潤亦減輕。 5.小鼠心肌梗死后纖維化面積的變化 Masson染色檢測心肌梗死后4周小鼠心肌纖維化的面積。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較,模型對照組小鼠心臟梗死區(qū)及梗死邊緣區(qū)域可見纖維增生、排列紊亂；與模型對照組比較,姜黃素高、低劑量組及依那普利組心肌纖維化的面積減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；與依那普利組比較,姜黃素低劑量纖維化面積增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),姜黃素高劑量組纖維化面積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.771)。 6.免疫組織化學(xué)法檢測心肌非梗死區(qū)Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的蛋白表達(dá)以及Ⅰ/Ⅲ膠原的比值結(jié)果 結(jié)果顯示：假手術(shù)組未見明顯膠原蛋白表達(dá),無基質(zhì)纖維化表現(xiàn)；與假手術(shù)組比較,模型對照組、依那普利組、姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組左室非梗死區(qū)纖維化表現(xiàn)明顯,可見Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)明顯增加,Ⅰ/Ⅲ膠原蛋白的比值顯著增加(P0.01)。與模型對照組比較,依那普利組、姜黃素高低劑量組膠原纖維表達(dá)程度有所減輕,Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)明顯減少,Ⅰ/Ⅲ膠原蛋白的比值較模型對照組明顯減小(P0.01)。與依那普利組比較,姜黃素高、低劑量組膠原纖維化程度稍重,但膠原蛋白表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；姜黃素低劑量組Ⅰ/Ⅲ膠原蛋白的比值有所增加(P0.01),姜黃素高劑量組Ⅰ/Ⅲ膠原蛋白的比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.138)。與姜黃素低劑量組比較,依那普利組、姜黃素高劑量組纖維化程度無明顯差異,但兩組Ⅰ/Ⅲ膠原蛋白的比值下降明顯(P0.01)。 7.小鼠心肌細(xì)胞凋亡的測定結(jié)果 模型制備及干預(yù)后3d,用TUNEL試劑盒檢測梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果顯示：與模型對照組比較,姜黃素高、低劑量組及依那普利組心肌細(xì)胞凋亡減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；姜黃素低劑量較依那普利組及姜黃素高劑量組心肌細(xì)胞凋亡增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；姜黃素高劑量組與依那普利組心肌細(xì)胞凋亡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.356)。 結(jié)論： 1.采用結(jié)扎模型小鼠冠狀動(dòng)脈左前降支,觀察局部心肌顏色、活動(dòng)度及心電圖變化,成功制作了AMI小鼠模型,其組織形態(tài)學(xué)、心功能及膠原蛋白表達(dá)檢測均表明模型小鼠存在心室重構(gòu)的病理改變。 2.姜黃素可改善心肌梗死后小鼠的心功能,抑制心肌肥厚,減緩心室重塑,與陽性對照藥依那普利有相近的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 3.姜黃素可調(diào)節(jié)不同類型膠原蛋白的表達(dá),減少心肌梗死后纖維化面積。 4.姜黃素能減少心肌細(xì)胞凋亡,提示這可能是姜黃素改善AMI后心室重構(gòu)的作用機(jī)制之一。 5.姜黃素低、高劑量組均可不同程度改善心肌梗死后小鼠心室重構(gòu)的各項(xiàng)檢測指標(biāo),且姜黃素高劑量的作用效果優(yōu)于姜黃素低劑量組,其心臟保護(hù)作用有一定的劑量依賴關(guān)系。 第二部分姜黃素對小鼠心肌梗死后炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制研究 目的： 炎癥反應(yīng)是心肌梗死后心室重構(gòu)的重要環(huán)節(jié),是慢性心力衰竭發(fā)展的基本機(jī)制。NF-κB信號(hào)通路活化可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)及心肌細(xì)胞凋亡。有研究報(bào)道姜黃素可抑制TLR4、NF-κB信號(hào)通路的激活,所以我們推測姜黃素可能通過下調(diào)梗死心肌組織中的TLR4的表達(dá),并抑制其下游NF-κB信號(hào)通路的活化,從而逆轉(zhuǎn)心肌梗死后心室重構(gòu),發(fā)揮改善心肌梗死后心功能的作用。本實(shí)驗(yàn)研究目的是觀察姜黃素對小鼠心臟梗死邊緣區(qū)樹突狀細(xì)胞的浸潤、梗死心肌組織中炎癥細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10的表達(dá)、梗死心肌組織中TLR4的表達(dá)及其下游NF-κB炎癥信號(hào)通道的影響。 方法： 1.實(shí)驗(yàn)分組 選用SPF級雄性C57BL/6小鼠,8-10周齡。按開胸后是否結(jié)扎前降支,分為假手術(shù)組及心肌梗死組。心肌梗死造模成功后,將存活小鼠隨機(jī)分為MI組、姜黃素組。 實(shí)驗(yàn)共分為三組：Ⅰ.假手術(shù)組(Sham);II.模型對照組(MI)；Ⅲ.姜黃素組(Cur)。Sham、MI組分別給予6%乙醇和6%聚乙二醇400混合液4ml/kg.d腹腔注射；姜黃素組分別給予姜黃素溶液4ml/kg.d(濃度25mg/ml)腹腔注射。各組小鼠正常飲食飲水,連續(xù)給藥4周。 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三組按模型制備及干預(yù)后3天(A)、7天(B)、14天(C)、28天(D)分為4個(gè)亞組。 2.標(biāo)本收集 心臟采血后處死小鼠,迅速開胸,剪下心臟,冰生理鹽水中洗盡血液,肉眼觀察心臟大體形態(tài),剪除左、右心耳及殘余大血管后以濾紙濾干,以電子天平稱取心臟實(shí)際重量(濕重),分別計(jì)算與體重的比值。各組分別取4只用于qPCR及Western-blot研究。心肌梗死邊緣區(qū)域,判斷梗死區(qū)主用通過肉眼觀察到心肌變白,梗死邊緣區(qū)主要為梗死瘢痕外約lmm以內(nèi)區(qū)域。在取材過程中,為了更好的界定梗死邊緣區(qū)與非梗死的左心室,先將梗死瘢痕外約1.5mm以外的心肌組織去除,剪下梗死邊緣區(qū)域心肌組織后,其余心肌組織快速地置于液氮中,然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存(假手術(shù)組樣本留取相對應(yīng)的左室心肌組織)。其余小鼠留取心臟用于免疫組織化學(xué)研究。沿著結(jié)扎線,并垂直于心臟的長軸將心臟剪成兩半,留取心臟結(jié)扎線至心尖的那一部分,置于4%的福爾馬林溶液中固定保存,用于免疫組織化學(xué)研究。 3.免疫熒光法檢測梗死邊緣區(qū)心肌組織中樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)的變化 選取模型制備及干預(yù)后3d、7d、14d、28d組小鼠(每組各5只,假手術(shù)組僅取3d組作為對照),留取小鼠梗死及邊緣區(qū)心肌,石蠟包埋切片后,用免疫熒光法檢測梗死邊緣區(qū)心肌組織中CD11c陽性表達(dá)。 4.Western Blot法測定小鼠梗死心肌組織中蛋白的表達(dá) 選取模型制備及干預(yù)后7d組小鼠(每組各4只),提取梗死心肌中的總蛋白,通過western blot檢測TLR4、iNOS以及NF-κB信號(hào)通路蛋白——NF-κB p65、 IκBα和IκB蛋白激酶α/β(IKKα/β)的總蛋白及磷酸化表達(dá)水平的表達(dá)。 5.qPCR檢測梗死區(qū)心肌組織中TLR4及炎癥因子的表達(dá) 選取模型制備及干預(yù)后3d、7d、28d組小鼠(每組各4只,假手術(shù)組僅取3d組作為對照),提取梗死心肌中的RNA,通過qPCR檢測梗死心肌組織中TLR4mRNA以及炎癥細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10mRNA的表達(dá)。 6.數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。方差齊時(shí),組間多重比較則采用LSD法；若方差不齊則采用Welch穩(wěn)健估計(jì),組間多重比較則采用Dunnett's T3法。P0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.姜黃素對梗死邊緣區(qū)心肌組織中樹突狀細(xì)胞浸潤的影響 采用石蠟切片免疫熒光法檢測心梗邊緣區(qū)表面抗原為CD11c陽性的樹突狀細(xì)胞浸潤情況。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組(僅取3d組作為對照)比較,模型對照組梗死邊緣區(qū)心肌組織中CDllc陽性的樹突狀細(xì)胞浸潤在心梗3d組明顯增多,心梗7d組達(dá)到峰值,其后開始逐漸減少,28d后基本恢復(fù)正常。與模型對照組比較,在各對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)姜黃素亞組中,梗死邊緣區(qū)心肌組織中的樹突狀細(xì)胞浸潤均有所減少(P0.05)。2.姜黃素對梗死心肌組織中炎癥細(xì)胞因子的影響 qPCR檢測了梗死心肌組織中促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6及抑炎因子IL-10的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示：與假手術(shù)比較(僅取3d組作為對照),模型對照組梗死心肌組織中促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)上調(diào),3d組最高,7d組有所下降,28d基本恢復(fù)正常；抑炎因子IL-10在3d組、7d組基本沒有變化,28天組表達(dá)有所上調(diào)(P=0.031)。與模型對照組比較,姜黃素在3d、7d各對應(yīng)亞組中梗死心肌組織中促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)均有所下調(diào)(P0.05),28d時(shí)基本都恢復(fù)正常；抑炎因子IL-10在心梗后3d、7d、28d時(shí)與模型對照組無明顯差異,但較假手術(shù)組有所上升(P=0.002)。 3.姜黃素對梗死心肌組織中iNOS蛋白的影響 Western blot法檢測假手術(shù)組、模型對照組、姜黃素組7d亞組小鼠梗死心肌組織中iNOS蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較,模型對照組小鼠梗死心肌組織中iNOS蛋白水平顯著增加(P0.05),而姜黃素組iNOS蛋白水平也顯著增加(P0.05)；而與模型對照組比較,姜黃素組iNOS表達(dá)水平顯著降低(P0.05)。 4.姜黃素對梗死心肌組織中TLR4水平的影響 Western blot和qPCR分析檢測假手術(shù)組、模型對照組、姜黃素組7d亞組小鼠梗死心肌組織中TLR4蛋白和mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較,模型對照組小鼠梗死心肌組織中TLR4mRNA和蛋白水平顯著增加(P0.05),姜黃素組TLR4表達(dá)水平明顯降低(P0.05)。 5.姜黃素對NF-κB炎癥信號(hào)通路的影響 為了進(jìn)步一闡明姜黃素抑制NF-κB炎癥信號(hào)通路的活化,本研究采用western blot法檢測了假手術(shù)組、模型對照組、姜黃素組7d亞組小鼠梗死心肌中NF-κB p65.IκBα和IκB蛋白激酶α/β(IKKα/β)的總蛋白及磷酸化表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較,模型對照組IκBα及IKKα/β的磷酸化水平增加(P0.05),表明IKK復(fù)合物活化使IκBa處于磷酸化水平,從而激活TNF-κBp65,使p-NF-κBp65表達(dá)明顯增多(P0.05),而姜黃素組較模型對照組IκBα及IKKα/β的磷酸化水平降低(P0.05)。表明姜黃素通過抑制IKKα/β活化來抑制IκBα磷酸化,最終抑制NF-κBp65信號(hào)通路的激活,發(fā)揮了抑制炎癥反應(yīng)的作用。 結(jié)論： 1.心肌梗死急性期早期,炎癥反應(yīng)增強(qiáng),梗死心肌局部的促炎癥細(xì)胞因子IL-1p、IL-6、TNF-α表達(dá)上調(diào),梗死心肌邊緣區(qū)樹突狀細(xì)胞浸潤增多,而姜黃素可以調(diào)控樹突狀細(xì)胞在梗死心肌邊緣區(qū)的浸潤,并下調(diào)促炎癥因子的表達(dá),抑制梗死心肌局部的炎癥反應(yīng)；急性心梗的炎癥反應(yīng)晚期,抑炎癥細(xì)胞因子IL-10表達(dá)上調(diào),姜黃素可以上調(diào)其表達(dá)。這些結(jié)果提示我們姜黃素在心室重構(gòu)炎癥反應(yīng)早期,可通過抑制促炎因子的表達(dá)來減輕炎癥反應(yīng),以免過度的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致不良的心室重構(gòu)；炎癥反應(yīng)后期可通過上調(diào)抑炎因子的表達(dá),從而發(fā)揮炎癥清除作用。這可能是姜黃素發(fā)揮心肌梗死后心室重構(gòu)保護(hù)作用的免疫調(diào)控機(jī)制之一。 2.iNOS在心肌損傷后觸發(fā)非特異性免疫反應(yīng)的過程中發(fā)揮著重要作用,有研究證實(shí)iNOS的表達(dá)與促炎癥因子誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及纖維化正相關(guān)。姜黃素可抑制心梗后梗死心肌中iNOS蛋白的表達(dá),這可能是其減少心肌細(xì)胞凋亡及心肌梗死纖維化面積的機(jī)制之一。 3.姜黃素可下調(diào)梗死心肌中TLR4的表達(dá),并可以通過阻斷其下游NF-κB的經(jīng)典激活途徑,其主要是通過抑制KKα的活化來抑制IjBα磷酸化,最終抑制NF-κBp65的激活。NF-κB的經(jīng)典激活途徑主要參與機(jī)體的急慢性炎癥反應(yīng),NF-κB(?)是心肌梗死后炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子之一。姜黃素可抑制TNF-κB通路的活化,這也可能是姜黃素發(fā)揮抑制心肌梗死后炎癥反應(yīng)的作用途徑之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2276702