【摘要】：【目的】將H9N2亞型禽流感病毒在豚鼠體內(nèi)連續(xù)性傳播9代后,能夠穩(wěn)定的在豚鼠間傳播,可見H9N2亞型禽流感病毒對哺乳動物的感染能力以及在哺乳動物間傳播的能力還是很強的。因此,使用此株病毒A/Chicken/Jinan/Li-2/2010(H9N2)簡稱JN,應(yīng)用小鼠動物模型,研究H9N2亞型流感病毒在小鼠肺內(nèi)適應(yīng)性傳代后對小鼠的致病力,以及傳代過程中流感病毒的變異。檢測和篩選流感病毒致病性變異的關(guān)鍵氨基酸位點,探索H9N2亞型流感病毒變異的分子機(jī)制。【方法】將一株H9N2亞型禽流感病毒A/Chicken/Jinan/Li-2/2010(H9N2)在小鼠的肺臟進(jìn)行傳代,將小鼠解剖、摘除肺部、研磨離心后經(jīng)滴鼻接種下一代小鼠,傳播九代后,用MDCK細(xì)胞擴(kuò)繁病毒,得到鼠肺適應(yīng)株JN-P9-2-M1;擴(kuò)增、克隆傳代病毒JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1的全基因測序,推斷各基因編碼的氨基酸,與JN原代病毒(P0)的核苷酸和氨基酸相比對,得到各代次病毒核苷酸與氨基酸變化的位點;解剖小鼠,獲得小鼠的肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦和腸,滴定各組織中的病毒滴度,檢測病毒的組織噬性;乙醚麻醉小鼠后,每個病毒稀釋度鼻內(nèi)接種3只小鼠,檢測小鼠的幸存率和發(fā)病率;采集攻毒小鼠的肺部,固定后進(jìn)行病理切片和免疫組化,比較JN原代病毒與JN-P9-2-M1對小鼠肺部的損害。【結(jié)果】JN-P9-2-M1對小鼠的致病性明顯提高,其MLD50為103.5EID50,106EID50、105EID50、104EID50攻毒劑量的小鼠幸存率是0,而原毒JN對小鼠不致死,JN-P9-2-M1對小鼠的致病性比原毒提高了至少1 000倍;攻入JN-P9-2-M1病毒劑量為106—103EID50的小鼠,體重明顯減少,臨床癥狀也很明顯,攻毒后3—8 d,小鼠表現(xiàn)精神萎靡、被毛零亂、呼吸急促、弓背等癥狀,而原毒JN在106EID50時,小鼠的體重變化率都跟陰性對照組相似;JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1同原毒JN的受體結(jié)合特性相同,都是只能特異性結(jié)合SAa-2,6Gal受體,具有人樣流感病毒的受體結(jié)合特性;JN病毒僅能在小鼠肺部檢測到,病毒滴度很高,而JN-P9-2-M1不僅在小鼠肺部有很高的滴度,在小鼠的肝臟、脾臟、腎臟和腦部都能檢測到。【結(jié)論】JN-P9-2-M1對小鼠的致病性明顯提高,比原毒提高了至少1 000倍;PB2 E627K、HA N313D和HA N496S等3個位點可能是病毒對小鼠致病力初步提高的原因,而PA L342I和NA N218T這兩個點突變,就有可能是進(jìn)一步提高病毒對小鼠致病力的關(guān)鍵位點。
[Abstract]:[objective] after the continuous transmission of H9N2 subtype avian influenza virus in guinea pigs for 9 generations, the virus could be transmitted steadily between guinea pigs. It can be seen that the infection ability of H9N2 subtype avian influenza virus to mammals and the ability of transmission among mammals are still very strong. Therefore, the mouse model of A/Chicken/Jinan/Li-2/2010 (H9N2) was used to study the pathogenicity of H9N2 subtype influenza virus in the lung of mice and the variation of influenza virus in the course of passage. To detect and screen the key amino acid sites of influenza virus pathogenicity variation, to explore the molecular mechanism of influenza virus variation of H9N2 subtype. [methods] A strain of H9N2 subtype avian influenza virus A/Chicken/Jinan/Li-2/2010 (H9N2) was subcultured in the lungs of mice and dissected in mice. The lungs were removed, and the next generation mice were inoculated by nasal drip after grinding and centrifugation. After nine generations of transmission, the MDCK cells were used to spread the virus. The JN-P9-2-M1; amplification of mouse lung adaptation strain was obtained. The whole gene of JN-P5-2-M1 and JN-P9-2-M1 was cloned and sequenced, and the amino acids encoded by each gene were deduced. In comparison with nucleotide and amino acid pairs of JN primary virus (P0), the sites of nucleotide and amino acid changes in each passage of virus were obtained, and the viral titers in lung, liver, spleen, kidney, brain and intestine were obtained by dissecting the mice. After anaesthetized mice with ether, 3 mice were inoculated with each virus diluted nose to detect the survival rate and morbidity of the mice, and the lungs of the mice were collected and fixed for pathological sections and immunohistochemistry. [results] the pathogenicity of JN-P9-2-M1 on mice was significantly improved by comparing the damage of primary JN virus and JN-P9-2-M1 to the lungs of mice. The survival rate of mice whose MLD50 was at the dose of 103.5EID50106EID50105EID50104EID50 attack was 0, and the pathogenicity of JN to mice was at least 1 000 times higher than that of the original virus, and the weight and clinical symptoms of the mice with the dose of JN-P9-2-M1 virus 106-103EID50 were obviously decreased, and the clinical symptoms were also obvious. At 3-8 days after poisoning, the mice showed symptoms such as listlessness, disorder of hair, shortness of breath, back of bow, etc. In 106EID50, the change rate of body weight of JN was the same as that of the negative control group, JN-P5-2-M1 and JN-P9-2-M1 had the same receptor binding characteristics with JN. JN virus can only be detected in the lungs of mice, the titer of JN virus is very high, and JN-P9-2-M1 has very high titer not only in the lungs of mice, but also in the liver and spleen of mice. [conclusion] the pathogenicity of JN-P9-2-M1 in mice was significantly increased, and the pathogenicity of JN-P9-2-M1 was increased by at least 1 000 times than that of the original virus. The three sites, such as HA N313D and HA N496S, may be the reasons for the initial increase of the virulence of the virus to mice. The point mutations of PA L342I and NA N218T may be the key sites to further improve the virulence of the virus to mice.
【作者單位】： 東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院;軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所/吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點實驗室;
【基金】：國家科技支撐計劃(2012ZX10004301-008)
【分類號】：S855.3

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 官旭華;;人感染H7N9禽流感研究進(jìn)展[J];公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué);2013年06期

2 劉曉斌;王亞萍;劉永仙;葛繁梅;符兆英;;流感病毒感染的樹突狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機(jī)制[J];公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué);2014年03期

3 張海明;沈丹;段曉冬;彭聰;;馬流感病毒的跨物種傳播及鳥類在其傳播中的作用探討[J];廣東畜牧獸醫(yī)科技;2014年05期

4 謝懷根;;流感病毒的變異及其研究現(xiàn)狀[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年28期

5 馬勇;徐曉龍;王秀榮;陳化蘭;;應(yīng)對高致病性禽流感病毒H5N1抗原漂移的通用疫苗策略[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2015年05期

6 宋高鵬;申新田;黎奕斌;鄭宇珊;熊平;劉叔文;;馬鈴薯三糖熊果酸衍生物抑制H5N1流感病毒進(jìn)入靶細(xì)胞[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2015年06期

7 徐寧;姜楠;孫偉;李翠;;淺談流感病毒的HA突變與受體識別的關(guān)系[J];現(xiàn)代畜牧獸醫(yī);2013年09期

8 閆章才;薛麗香;李國才;高福;董爾丹;;流行性感冒防控基礎(chǔ)研究狀況及關(guān)鍵科學(xué)問題分析[J];中國科學(xué):生命科學(xué);2014年01期

9 劉曉文;鐘蕾;王曉泉;胡順林;劉東;劉秀梵;;表達(dá)綠色熒光蛋白重組H9N2流感病毒的拯救及生物學(xué)特性[J];揚州大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版);2013年04期

10 朱宇;陳廣仁;史永超;蘇青;;2013年度中國重大科學(xué)、技術(shù)和工程進(jìn)展[J];科技導(dǎo)報;2014年03期

相關(guān)會議論文 前3條

1 徐康維;李長貴;許凱;李娟;邵銘;劉書珍;王軍志;;B型流感病毒血凝素純化[A];2012年中國藥學(xué)大會暨第十二屆中國藥師周論文集[C];2012年

2 畢英佐;嚴(yán)專強;李海燕;;科學(xué)引導(dǎo),正確對待甲型H7N9流感[A];第四屆（2014）中國黃羽肉雞行業(yè)發(fā)展大會會刊[C];2014年

3 路開順;劉軍;孫寶霞;李剛;張濤;袁德印;;山東省2例人感染H7N9禽流感確診病例感染因素分析[A];產(chǎn)業(yè)競爭力與創(chuàng)新驅(qū)動——2014年山東省科協(xié)學(xué)術(shù)年會論文集[C];2014年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張坤;豚鼠抗流感病毒相關(guān)因子研究及H9N2亞型禽流感病毒致病力分析[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

2 王秋霞;小反芻獸疫病毒樣顆粒的裝配與釋放研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

3 程凱慧;H6N1亞型禽流感對哺乳動物的傳播與致病機(jī)制研究[D];石河子大學(xué);2013年

4 謝曉平;乙肝DNA疫苗聯(lián)合佐劑的免疫效果評價及抗H7N9流感病毒新策略的研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

5 黃蓉;禽源H9N2 AIV對哺乳動物的感染及其引起肺部細(xì)胞因子與蛋白組變化的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

6 范勝濤;野鳥禽流感監(jiān)測及哺乳動物跨種傳播能力評估[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

7 王景鋒;A型流感病毒RNA節(jié)段特異性非編碼區(qū)在病毒復(fù)制中的作用研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

8 尹海龍;茄屬中草藥天茄籽和白英抗H5N1病毒活性成分研究[D];北京工業(yè)大學(xué);2013年

9 包紅梅;禽流感病毒RT-LAMP系列檢測方法的建立和應(yīng)用[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

10 武科科;禾谷縊管蚜體內(nèi)與傳播WYDV-GPV相關(guān)的蛋白的篩選和鑒定[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 馮安林;火雞的流感病毒唾液酸受體分布特點及其在流感病毒生態(tài)系統(tǒng)中的位置和作用[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2013年

2 吳崇超;藍(lán)藻抗病毒蛋白CVN及衍生物抗甲型流感體內(nèi)外活性的研究[D];暨南大學(xué);2013年

3 文雪霞;H5N1亞型禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白單克隆抗體的制備及其表位研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

4 丁潔;H6N1亞型AIV在豚鼠間傳播能力及H9N2亞型AIV對小鼠致病性研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2013年

5 孫偉;哺乳動物呼腸孤病毒MPC/04株冷凍電鏡三維重建[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

6 溫峰;基于反向遺傳操作構(gòu)建的重組H1N1豬流感病毒疫苗免疫效力研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

7 張艷;甲型H1N1流感病毒HA上糖基化位點及H1N2豬流感病毒致病性研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

8 汪崇文;流感病毒血凝素抑制肽結(jié)構(gòu)修飾與活性評價[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2013年

9 吳超;不同Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶切割流感病毒HA效率的比較及表達(dá)TMPRSS2和MSPL的MDCK穩(wěn)定細(xì)胞系的建立[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

10 王俊亞;河南省豬流感病毒的分離鑒定及生物學(xué)特性研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 張淑嫻;基于釀酒酵母原始株與乙醇適應(yīng)株間的差異分析乙醇耐受性機(jī)制[D];北京化工大學(xué);2014年

2 瑪依拉;1、雞抗EV71卵黃抗體制備及其抗病毒作用研究 2、甲型H1N1流感病毒基因多態(tài)性對病毒復(fù)制及毒力的影響研究 3、季節(jié)性流感病毒H1N1 BALB/c鼠肺適應(yīng)株的建立及潛在分子機(jī)理研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

，

本文編號：2239911