發(fā)布時間：2018-08-21 14:06

【摘要】：第一部分培養(yǎng)新生SD原代大鼠海馬神經元、觀察其形態(tài)學改變及純度鑒定目的:掌握新生SD大鼠海馬神經元的體外培養(yǎng)技術;觀察新生原代大鼠SD海馬神經元的形態(tài)學改變;采用免疫熒光細胞化學方法鑒定神經元純度。方法:取新生24h內的SD乳鼠,用碘酊和75%乙醇消毒,剪斷頭,分層剪開大鼠頭部的皮膚和打開顱骨,用彎鑷取出其整個大腦,置于預先冷卻的DMEM液中,找到并剝離兩側完整的海馬組織,置于解剖顯微鏡下,剝離并去除海馬表面的血管和被膜,移入加有木瓜酶的DMEM中,溫度為37°C,置于5%CO2培養(yǎng)箱中,消化30分鐘。置入含有10%血清的DMEM液中2分鐘,終止組織消化。在含有血清的DMEM液中,用維納斯剪剪碎消化完成的組織塊,反復輕輕吹打三到五次,置入200目細胞篩,過篩。取0.9 ml篩過的組織液,采用臺盼藍拒染法,計量活細胞數(shù),將配制成1×106/ml密度的細胞懸液,每孔加500μl,種植于Matrigel基膜包被的24孔培養(yǎng)板上,置于恒溫37°C,5%CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)6 h。全量更換成無血清Neurobasal培養(yǎng)基。于培養(yǎng)的第48 h時,加入終濃度為10μmol/L的阿糖胞苷。此后每2天半量更換培養(yǎng)液,密切觀察神經元的生長狀態(tài)。于培養(yǎng)7天后,應用免疫熒光化學技術,按不同的熒光標記得情況,可以分清神經元和星形膠質細胞。應用熒光顯微鏡觀察神經元的狀況并鏡下留取照片,用于計數(shù)。按照隨機原則,分別選取3個孔的隨機3個視野,高倍視野(10×20倍)下,對神經元、星形膠質細胞及所有細胞核進行計數(shù),通過計算神經元所占的百分比的均值,作為每孔神經元純度。結果:體外培養(yǎng)的新生原代SD大鼠海馬神經元,形態(tài)典型,突起連接成網,生長狀態(tài)良好;體外培養(yǎng)的新生原代SD大鼠海馬神經元細胞核染色清晰,海馬神經元純度為(94.81±1.90)%,各組間比較無統(tǒng)計學意義(p=0.81)。結論:體外培養(yǎng)的原代sd新生乳鼠海馬神經元形態(tài)典型,純度在90%以上,能夠滿足進一步的實驗要求。第二部分七氟醚對發(fā)育期海馬神經元的影響目的:探討七氟醚對原代培養(yǎng)的發(fā)育期6d的sd乳鼠海馬神經元影響方法:取原代培養(yǎng)第6d的海馬神經元,隨機分為4組:對照組(c組)七氟醚組隨機分成3組,分別供應對照組空氣,1MAC七氟醚3h、6h、12h的七氟醚處理(f1組、f2組、f3組)。所有海馬神經元繼續(xù)培養(yǎng)12h后,為各組神經元全量換液,并用pbs清洗2次,加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h,隨機選取視野為神經元拍照。所得照片用moticmed6.0軟件處理,使用其測量長度工具測量視野內軸突和樹突的總長度,計數(shù)該視野神經元總數(shù),以該視野神經元平均突起總長度作為統(tǒng)計指標。用免疫熒光化學法測定各組神經元突觸素的含量,采集突觸素熒光圖像,用image-proplus6.0軟件分析各組突觸素的平均熒光密度(mod,meanopticaldensity)。用流式細胞檢測檢測技術,檢測各組海馬神經元的凋亡情況。結果:1MAC七氟醚暴露3小時(f1組)同對照組(c組),神經元平均突起總長度差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);f2組及f3組與c組比較,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);f2組和f3與f1組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。f2組及f3組與c組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);f1組與c組比較,差異無統(tǒng)計學意義;f2組和f3與f1組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。1MAC七氟醚暴露3小時(f1組)較對照組(c組),神經元凋亡率無明顯差別,無統(tǒng)計學意義(p0.05);隨著1MAC七氟醚暴露的時間延長及f2和f3組,神經元凋亡率逐漸增高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);f2和f3組與c組和f1組比較,f2組和f3組神經元凋亡率增高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結論:1MAC七氟醚暴露6小時及以上影響原代培養(yǎng)的乳鼠海馬神經元突起及突觸的發(fā)育,引起海馬神經元的凋亡增加,可能引起乳鼠成年后學習和記憶功能的降低。第三部分七氟醚對發(fā)育期海馬神經元影響的可能機制目的:探討七氟醚對發(fā)育期海馬神經元影響的可能機制。方法:取原代培養(yǎng)第6d的海馬神經元,隨機分為4組:空白對照組(c組)、1MAC七氟醚3小時組(f1組)、1MAC七氟醚6小時組(f2組)、1MAC七氟醚12小時(f3組)。f1、f2、f3組分別暴露于1MAC七氟醚下;c組暴露于空氣下。將海馬神經元置于恒溫水浴箱中,保持溫度于37°c,應用drager麻醉機,給于6l/min的氣體流量,1MAC的七氟醚混合95%的空氣和5%的co2,連接已預先制備的玻璃容器內,應用七氟醚氣體檢測儀檢測氣體濃度,維持七氟醚在容器內為1MAC。對照組置于玻璃器皿內給于除七氟醚以外的氣體。12小時后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。westernblot檢測各組bdnf和trkb蛋白的表達。結果:bdnf水平在暴露于1MAC七氟醚6小時(f2組)、12小時(f3組)較對照組(c組)圖像可見有明顯的降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);而暴露于1MAC七氟醚3小時(f1組)bdnf水平較對照組(c組)圖像可見有明顯的升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。bdnf灰度值水平,在暴露于1MAC七氟醚6小時(f2組)、12小時(f3組)較對照組(c組)有明顯的降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);而暴露于1MAC七氟醚3小時(f1組)bdnf水平較對照組(c組)有明顯的升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。c組和f1組、f2組、f3組內參β-actin條帶灰度值,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。trkb水平在暴露于1MAC七氟醚6小時(f2組)、12小時(f3組)較對照組(c組)圖像可見有明顯的降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);而暴露于1MAC七氟醚3小時(f1組)trkb水平較對照組(c組)圖像可見有明顯的升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。trkb灰度值水平在暴露于1MAC七氟醚6小時(f2組)、12小時(f3組)較對照組(c組)有明顯的降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);而暴露于1MAC七氟醚3小時(f1組)trkb水平較對照組(c組)有明顯的升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。c組和f1組、f2組、f3組內參β-actin條帶灰度值,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。結論:1 1MAC七氟醚暴露3小時增加了體外培養(yǎng)海馬神經元bdnf和trkb表達但未引起海馬神經元凋亡、突起和突觸發(fā)育的改變。2 1MAC七氟醚暴露時間6小時減少體外培養(yǎng)海馬神經元bdnf和trkb表達可能是七氟醚響海馬神經元突起及突觸發(fā)育和神經元細胞凋亡的分子機制之一。3七氟醚對體外培養(yǎng)海馬神經元的影響具有雙向性,可能與七氟醚暴露的時間有關,其機制可能與七氟醚引起的bdnf和trkb表達的改變相關。第四部分右美托咪定對七氟醚引起的發(fā)育期海馬神經元的神經毒性的影響目的:探討右美托咪定對七氟醚引起的發(fā)育期海馬神經元毒性的影響。方法:取原代培養(yǎng)第6d的海馬神經元,隨機分為5組:空白對照組(c組)、1MAC七氟醚組(f組)、右美托咪定組(d組)、1MAC七氟醚加右美托咪定組(fd組)、育亨賓組(y組)。fd組分成fd1組給于右美托咪定0.1umol/l;fd2組給于右美托咪定1umol/l;fd3組給于右美托咪定10umol/l。y組分成:y1組,y2組,y3組分別給予右美托咪定0.1umol/l,1umol/l,10umol/l。f組、fd組和y組分別暴露于1MAC七氟醚下6小時;d組加入生理鹽水稀釋的右美托咪定,使其終濃度為100nmol/l,fd組采取1MAC七氟醚混合95%的空氣和5%的co2,6h同時加入生理鹽水稀釋的右美托咪定,使其終濃度為100nmol/l,c組和d組采用95%的空氣和5%的co2,y組先加入育亨賓,使其終濃度為2umol/l,再加入右美托咪定和七氟醚,終濃度同fd組,f組和c組加入等體積的生理鹽水。繼續(xù)培養(yǎng)12h后,為各組神經元全量換液,并用pbs清洗2次,加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h,棄去培養(yǎng)基,用pbs清洗兩次,收集每組細胞,利用westernblot技術分析各組腦源性神經營養(yǎng)因子(bdnf,brain-derivedneurotrophicfactor)及其特異性受體trkb和坍塌反應調節(jié)蛋白2(crmp-2,collapsinresponsemediatorprotein-2)表達的改變。利用gelimageanalysisv2.02軟件分析各條帶的灰度值,bdnf,trkb和crmp-2蛋白的相對量分別以bdnf,trkb和crmp-2條帶的灰度值與內參β-actin條帶灰度值的比值表示。用流式細胞檢測檢測技術,檢測各組海馬神經元的凋亡情況。結果:1比較各組bdnf,trkb和crmp-2蛋白的表達(1)bdnf:bdnf的表達水平,1MAC七氟醚暴露6小時(f組)及同時給于濃度為0.1umol/l、1umol/l、10umol/l右美托咪定(fd組)和y組比對照組(c組),數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);單純右美托咪定組和對照組之間表達無明顯差別,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);而復合1MAC七氟醚和三種劑量右美托咪定均較單純1MAC七氟醚暴露,bdnf表達水平有所升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);fd1組較fd2組和fd3組,bdnf表達水平明顯降低(p0.05),fd2組與fd3組間表達無明顯差別(p0.05);復合1MAC七氟醚、右美托咪定和育亨賓時,bdnf的表達水平較單純1MAC七氟醚,數(shù)值有所升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);復合1MAC七氟醚、右美托咪定和育亨賓時,bdnf的表達水平較fd組,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)而當給于不同劑量的右美托咪定的y1組、y2組和y3組間,bdnf表達無明顯差別。(2)trkb:trkb的表達水平,1MAC七氟醚暴露6小時(f組)及同時給于濃度為0.1umol/l、1umol/l、10umol/l右美托咪定(fd組)和y組比對照組(c組),數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);單純右美托咪定組和對照組之間表達無明顯差別,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);而復合1MAC七氟醚和三種劑量右美托咪定均較單純1MAC七氟醚暴露,trkb表達水平有所升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);fd1組較fd2組和fd3組,trkb表達水平明顯降低(p0.05),fd2組與fd3組間表達無明顯差別(p0.05);復合1MAC七氟醚、右美托咪定和育亨賓時,trkb的表達水平較單純1MAC七氟醚,無明顯差異(p0.05);復合1MAC七氟醚、右美托咪定和育亨賓時,trkb的表達水平較fd組,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)而當給于不同劑量的右美托咪定的y1組、y2組和y3組間,trkb表達無明顯差別(p0.05)。(3)crmp-2:1MAC七氟醚暴露6小時(f組)及同時給于濃度為0.1umol/l、1umol/l、10umol/l右美托咪定(fd組)和y組比對照組(c組),數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);單純右美托咪定組和對照組之間表達無明顯差別,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);而復合1MAC七氟醚和三種劑量右美托咪定均較單純1MAC七氟醚暴露,crmp-2表達水平有所升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);fd1組較fd2組和fd3組,crmp-2表達水平明顯降低(p0.05),fd2組與fd3組間表達無明顯差別(p0.05);復合1MAC七氟醚、右美托咪定和育亨賓時,crmp-2的表達水平較單純1MAC七氟醚,數(shù)值有所升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);復合1MAC七氟醚、右美托咪定和育亨賓時,crmp-2的表達水平較fd組,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)而當給于不同劑量的右美托咪定的y1組、y2組和y3組間,crmp-2表達無明顯差別(p0.05)。2比較各組海馬神經元細胞的凋亡情況。1MAC七氟醚暴露6小時(f組)及同時給于濃度為三種劑量的右美托咪定(fd組)和復合育亨賓的y組均較對照組(c組),神經元凋亡率明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);單純右美托咪定組和對照組之間表達無明顯差別,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);而復合1MAC七氟醚和右美托咪定較單純1MAC七氟醚暴露,神經元凋亡率明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),其中fd1組較fd2組和fd3組,神經元凋亡率明顯增高復合(p0.05)而fd2組與fd3組間無明顯差異(p0.05);1MAC七氟醚、右美托咪定和育亨賓時,神經元凋亡率較單純1MAC七氟醚,數(shù)值有所降低,較單純復合右美托咪定組,凋亡率明顯增高(p0.05);而給于不同劑量的右美托咪定復合七氟醚,育亨賓,y1組、y2組和y3組間無明顯差異(p0.05)。結論:1 1MAC七氟醚減少體外培養(yǎng)海馬神經元bdnf,trkb和crmp-2的表達可能是七氟醚影響海馬神經元突起及突觸發(fā)育的分子機制之一;2右美托咪定使七氟醚孵育的體外培養(yǎng)海馬神經元中bdnf,trkb和crmp-2的表達增加,可能是右美托咪定能減少七氟醚對體外培養(yǎng)海馬神經元突起及突觸發(fā)育影響的可能分子機制之一;但是右美托咪定本身卻使體外培養(yǎng)海馬神經元中TrkB的表達減少;3阻滯α2腎上腺素受體可導致BDNF表達減少;4咪唑啉受體可能參與了右美托咪定對七氟醚的神經毒性的保護作用(增加了CRMP的表達)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R614

【參考文獻】

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4 劉佩;劉U，

本文編號：2195978