【摘要】：在脊髓缺血再灌注損傷造成的遲發(fā)性癱瘓中，神經(jīng)元凋亡是細(xì)胞死亡的主要方式，是造成治療困難、療效不明顯的重要原因之一。ASK1-JNK/P38MAPK途徑是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑，抑制ASK1信號(hào)通路可減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。人參皂甙Rd是人參的主要成份之一，既往實(shí)驗(yàn)表明Rd對(duì)缺血性腦卒中具有明確的神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)于同屬中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脊髓組織，Rd是否同樣發(fā)揮保護(hù)作用，至今未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型，觀察腹腔注射Rd后大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能改善程度、組織病理變化及神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，探討Rd對(duì)脊髓缺血再灌注損傷是否具有神經(jīng)保護(hù)作用，以及這種作用是否與抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)，為進(jìn)一步明確Rd的藥理作用及應(yīng)用于臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的： 觀察人參皂甙Rd對(duì)SD大鼠脊髓缺血再灌注損傷后運(yùn)動(dòng)功能的改善情況并通過行為學(xué)分析、特殊染色、免疫組織化學(xué)染色、Western blot等方法相結(jié)合，揭示其可能的分子機(jī)制。 方法： 1、確定最佳治療劑量 隨機(jī)選擇SD大鼠30只，分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血/再灌注損傷組（I/R組）、6.25mg/kg Rd組、12.5mg/kg Rd組、25mg/kg Rd組、50mg/kg Rd組，每組5只；其中6.25mg/kg Rd組、12.5mg/kg Rd組、25mg/kg Rd組、50mg/kg Rd組為治療組。假手術(shù)組，僅打開腹腔，不夾閉腹主動(dòng)脈；I/R組，麻醉后切開大鼠腹腔，用動(dòng)脈夾阻斷腎動(dòng)脈水平以下腹主動(dòng)脈60分鐘后關(guān)腹，建立脊髓缺血/再灌注損傷模型；治療組，按照I/R組方法造成脊髓缺血/再灌注損傷模型，6.25mg/kg Rd組，每只鼠按照6.25mg/kg·d劑量給予人參皂甙Rd腹腔注射；12.5mg/kg Rd組，每只鼠按照12.5mg/kg·d劑量給予人參皂甙Rd腹腔注射；25mg/kg Rd組，每只鼠按照25mg/kg·d劑量給予人參皂甙Rd腹腔注射；50mg/kg Rd組，每只鼠按照50mg/kg·d劑量給予人參皂甙Rd腹腔注射。模型建立后每日觀察SD大鼠后肢及尾部運(yùn)動(dòng)情況，進(jìn)行BBB評(píng)分。全部30只SD大鼠于術(shù)后第5日處死，小心剝離胸13水平以下的脊髓組織，置于10%中性福爾馬林液4℃固定24小時(shí)，以腰2為中心修塊，長度3.0mm，常規(guī)石蠟包埋、固定，石蠟切片，蘇木精-伊紅染色（HE染色），根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳治療劑量。 2、確定最佳治療時(shí)間 隨機(jī)選擇SD大鼠20只，分為建模后1天組、建模后3天組、建模后5天組、建模后7天組，每組5只；四組均建立脊髓缺血再灌注損傷模型，具體方法同前，術(shù)后每日觀察SD大鼠下肢及尾部運(yùn)動(dòng)情況，進(jìn)行BBB評(píng)分，根據(jù)上一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各組每日均給予相同劑量（即前一步確定的最佳劑量25mg/kg·d）Rd腹腔注射；分別于建模后不同時(shí)間處死各組SD大鼠，取出脊髓組織進(jìn)行HE染色，方法同上，根據(jù)BBB評(píng)分及染色結(jié)果來確定最佳治療時(shí)間。具體情況為建模后1天組于建模后第1日處死，建模后3天組于建模后第3日處死，建模后5天組于建模后第5日處死；建模后7天組于建模后第7日處死。 3、大鼠脊髓切片的尼氏染色和Caspase3染色 尼氏染色法：石蠟切片常規(guī)脫蠟，0.25%的甲苯胺藍(lán)50℃3小時(shí)，脫色，脫水，，透明，中性樹膠封片。采用OLYMPUSBX53顯微鏡(Olympus)觀察，并用CellSens Dimension攝像系統(tǒng)(Olympus)顯微攝影。所得圖片采用Image-Pro Plus6.0軟件進(jìn)行圖像分析，并測(cè)得其灰度值。Caspase3染色方法：石蠟切片脫蠟和水化后，過氧化酶阻斷溶液孵育，正常非免疫動(dòng)物血清孵育后，每張切片加50μl羊抗鼠Caspase3抗體（稀釋度1：250）孵育60min，生物素標(biāo)記的抗羊免疫球蛋白試劑（試劑盒自帶）孵育，鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液孵育，新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察，蘇木素復(fù)染，返藍(lán)；梯度酒精脫水、透明，中性樹膠封固。免疫組織化學(xué)染色的標(biāo)本中，Caspase3陽性神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含棕色顆粒，非陽性神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無棕色顆粒。統(tǒng)計(jì)脊髓灰質(zhì)內(nèi)陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)和神經(jīng)細(xì)胞總數(shù)。計(jì)算Caspase3表達(dá)的陽性率，Caspase3表達(dá)的陽性率=陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)/神經(jīng)細(xì)胞總數(shù)×100%。Caspase3的表達(dá)情況是由陽性細(xì)胞的百分率和陽性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度共同決定的，陽性細(xì)胞百分率的得分是0（0%），1（1-10%），2（11-50%），3（51-80%），4（80%）；表達(dá)強(qiáng)度的得分是1（弱度），2（中度），3（強(qiáng)度）。最后的得分是表達(dá)率與表達(dá)強(qiáng)度得分的總和，總得分可以分為以下幾組：不表達(dá)（得分2），低表達(dá)（得分=2-3），中表達(dá)（得分=4-5），高表達(dá)（得分=6-7）。 4、Western blot方法檢測(cè)p38MAPK、ASK1、JNK 隨機(jī)選擇SD大鼠24只，分為對(duì)照組（Control組）、假手術(shù)組（Sham組）、缺血/再灌注損傷組（I/R組）、治療組（Treat組），每組6只。Control組，僅給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，不打開腹腔，術(shù)后每日腹腔注射生理鹽水；Sham組，僅打開腹腔后關(guān)腹，術(shù)后每日腹腔注射生理鹽水；I/R組，采用前述方法造成脊髓缺血再灌注損傷，術(shù)后不給予人參皂甙Rd，每日只給予腹腔注射生理鹽水；Treat組，建模方法同I/R組，參考前述實(shí)驗(yàn)確定的最佳治療劑量和最佳治療時(shí)間結(jié)果，每日給予人參皂甙Rd腹腔注射進(jìn)行治療。全部24只SD大鼠均于同一時(shí)間處死。游離出脊髓組織，置于勻漿器中裂解，勻漿并離心后測(cè)蛋白濃度。應(yīng)用蛋白測(cè)定試劑盒繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線，根據(jù)測(cè)得的樣品濃度，將樣品稀釋為統(tǒng)一濃度后，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜。加入WB二抗進(jìn)行免疫反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光、顯色、定影，圖像分析。采用Tanon Gel Image SystemID4.1.2系統(tǒng)進(jìn)行圖像攝影并分析。 結(jié)果： 1、通過結(jié)合各組大鼠BBB評(píng)分和HE染色切片評(píng)分，確定Rd的最佳治療劑量為25mg/kg·d。各組大鼠BBB評(píng)分的比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，組間比較（F=220.03,P0.001），不同時(shí)間比較（F=213.52, P0.001），劑量與時(shí)間存在交互作用（F=19.83,P0.001）。組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，Sham組與其他5組比較均有差別（P0.05），且Sham組評(píng)分均數(shù)最高（X=20.9）；I/R組與其他4組比較均有差別（P0.05），且I/R組評(píng)分均數(shù)最低（X=11.1）；除6.25mg/kg Rd組與12.5mg/kg Rd組之間、25mg/kgRd組與50mg/kg Rd組之間比較無差別（P0.05），治療組（6.25，12.5，25，50mg/kgRd組）各組之間均有差別（P0.05），且各組隨Rd腹腔注射劑量增加，BBB評(píng)分有逐漸增高的趨勢(shì)，6.25，12.5，25，50mg/kg Rd組每組BBB評(píng)分均數(shù)分別為（X=13.0,13.1,15.3,15.4），說明人參皂甙Rd的劑量與BBB評(píng)分的改善之間存在效應(yīng)-劑量關(guān)系。在術(shù)后不同時(shí)間比較中，治療組隨Rd腹腔注射劑量增加，除6.25mg/kg Rd組術(shù)后第1、2天之間比較無差別（P0.05），其余Rd組術(shù)后第1、2、3、4天之間比較均有差別（P0.05），治療組每個(gè)劑量組在第4、5天之間比較無差別（P0.05），提示到第4天后，BBB評(píng)分進(jìn)入一個(gè)平臺(tái)期。各組HE染色切片評(píng)分結(jié)果比較采用單因素方差分析（F=32.25, P0.001），組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。除25mg/kg Rd組與50mg/kg Rd組比較無差別（P0.05）外，其余任意兩組之間均有差別（P0.05）。故選擇最佳治療劑量為25mg/kg·d。 2、通過結(jié)合各組大鼠BBB評(píng)分和HE染色切片評(píng)分，確定Rd的最佳治療時(shí)間為5天。建模后7天組不同時(shí)間的BBB評(píng)分比較采用單因素方差分析（F=4.55, P=0.002），組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，除術(shù)后第1天與第4、5、6、7天之間比較有差別（P0.05）外，其余任意兩組之間比較均無差別（P0.05）。說明治療有效；HE染色切片顯示微觀結(jié)構(gòu)改變與行為學(xué)表現(xiàn)的改善相一致，脊髓組織的缺血再灌注損傷明顯減輕。對(duì)各組HE染色切片評(píng)分比較，采用單因素方差分析（F=3.66, P=0.035），組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，建模后5天組與建模后1天組、建模后3天組比較均有差別（P0.05），與建模后7天組比較無差別（P0.05）；建模后1天組與建模后3天組、建模后7天組比較無差別（P0.05）；建模后3天組與建模后7天組比較無差別（P0.05）。故選擇最佳治療時(shí)間為5天。 3、尼氏染色與Caspase3染色結(jié)果提示Rd對(duì)脊髓缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用主要與治療劑量相關(guān)。尼氏染色結(jié)果顯示在Sham組，脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元體積較大，細(xì)胞核染色淺，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)中尼氏體含量較多。I/R組；脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元體積較大，細(xì)胞核染色淺，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)尼氏體邊集，且染色深，6.25mg/kg Rd組：脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞核染色淺，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)尼氏體含量較多，但較缺血組有所減少，且染色不如缺血組的尼氏體染色深。12.5mg/kg Rd組、25mg/kg Rd組、50mg/kgRd組：脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞核染色淺，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)尼氏體含量多。測(cè)得的灰度值兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，Sham組與I/R組、6.25mg/kg Rd組、12.5mg/kg Rd組、25mg/kg Rd組、50mg/kg Rd組相比較，差別有顯著性（P0.05）；6.25mg/kg Rd組與I/R組相比較，差別有顯著性（P0.05）；12.5mg/kg Rd組與6.25mg/kg Rd組、25mg/kg Rd組與12.5mg/kg Rd組、50mg/kg Rd組與25mg/kg Rd組相比較，差別無顯著性（p0.05）。建模后1天組，建模后3天組，建模后5天組，建模后7天組，尼氏染色結(jié)果顯示各組脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞核染色淺，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)尼氏體含量多，隨治療時(shí)間延長，測(cè)量其灰度值變化，差別無顯著性（p0.05）。Caspase3染色結(jié)果評(píng)分后，兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，I/R組評(píng)分與Sham組差異有顯著性（p0.01），I/R組可見Caspase3陽性顆粒，說明部分神經(jīng)元細(xì)胞在脊髓缺血再灌注損傷后發(fā)生了凋亡；給予腹腔注射Rd治療后，6.25mg/kg Rd組評(píng)分與I/R組評(píng)分比較，差異有顯著性（p0.01），I/R組高于6.25mg/kg Rd組，說明治療有效；隨著Rd濃度的增加，12.5mg/kgRd組評(píng)分與6.25mg/kg Rd組評(píng)分比較，差異仍有顯著性（p0.05），6.25mg/kg Rd組高于12.5mg/kg Rd組，說明Rd對(duì)Caspase3表達(dá)的抑制作用呈濃度依賴式；隨著Rd濃度再進(jìn)一步增加，25mg/kg Rd組、50mg/kg Rd組的評(píng)分與Sham組比較，差異已無顯著性（p0.05），說明經(jīng)Rd積極治療后，Caspase3的表達(dá)已經(jīng)很少，甚至無表達(dá)。而在建模后1天組、建模后3天組、建模后5天組、建模后7天組，Caspase3染色結(jié)果提示，神經(jīng)元細(xì)胞大，細(xì)胞核圓，神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無Caspase3陽性顆粒生成，各組比較差異無顯著性（p0.05）。這一結(jié)果說明，在給予特定濃度Rd治療的情況下，隨著治療時(shí)間延長，Caspase3陽性細(xì)胞變化不明顯，提示Caspase3的表達(dá)對(duì)Rd的濃度變化較為敏感，對(duì)治療時(shí)間不敏感。 4、Western blot結(jié)果顯示Rd主要是通過ASK1-JNK途徑抑制脊髓缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而非p38MAPK。對(duì)于ASK1和JNK，I/R組與Sham組相比較，差異有顯著性（p0.01），說明模型建立成功；Treat組與I/R組相比較，差異有顯著性（p0.05），說明腹腔注射Rd治療有效，ASK1、JNK表達(dá)均下降。對(duì)于p38MAPK，I/R組與Sham組相比較，差異具有顯著性（p0.01），說明模型建立成功；Treat組與I/R組相比較，差異無顯著性（p0.05），說明Rd主要是通過ASK1-JNK途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，而非p38MAPK。 結(jié)論： 人參皂甙Rd對(duì)于大鼠脊髓缺血再灌注損傷后運(yùn)動(dòng)功能障礙可發(fā)揮明確的神經(jīng)保護(hù)作用，腹腔注射Rd不僅可以明顯改善大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能（BBB評(píng)分），改善微觀組織結(jié)構(gòu)病理性損害（HE染色），還可以減少神經(jīng)元凋亡；尼氏染色與Caspase3染色結(jié)果提示，Rd主要以劑量依賴方式來發(fā)揮作用，抑制Caspase3的表達(dá)，對(duì)治療時(shí)間的變化不敏感；Rd通過抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，與Rd對(duì)ASK1信號(hào)通路的表達(dá)抑制相關(guān)，主要是通過ASK1-JNK途徑，減少Caspase3的表達(dá)，而不是ASK1-p38MAPK途徑。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R651.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 趙慶華;賈連順;周許輝;宋滇文;;大鼠脊髓缺血再灌注損傷后MMP-9的基因表達(dá)變化[J];頸腰痛雜志;2007年03期

2 楊淵,張?zhí)K明,方思羽,張e

本文編號(hào)：2191753