【摘要】：研究背景和目的脂肪移植近年來作為軟組織修復重建的新興技術一直被廣泛應用于多個領域,如燒傷后的繼發(fā)畸形、慢性創(chuàng)面、創(chuàng)傷、放射性損傷以及腫瘤切除術后的繼發(fā)缺損。隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展,盡管外科技術水平不斷提高,尤其是BRAVA的出現(xiàn)和預處理脂肪移植受區(qū)使移植效果大大提高,脂肪移植技術仍面臨著供區(qū)不足以及移植最終保留率的不可預測性的難題。為了獲得更好的移植細胞的存活,細胞輔助的脂肪移植技術近年來在整形外科領域大受歡迎,尤其是SVF(stromal vascular fraction)細胞參與的脂肪移植技術被證實可以提高移植效果。SVF細胞是一類極具發(fā)展?jié)摿Φ募毎?對于移植物中血管化的快速建立大有脾益,因其具有多向分化潛力,通過脂肪抽吸術容易大量獲得而在細胞輔助脂肪移植中得到應用。然而,一項特定的限制因素是在臨床上需抽吸約雙倍量的脂肪分別用于移植和提取處理SVF細胞,這對于某些嚴重軟組織缺失的患者是不可行的。另外,這也同時使原有手術時間大大延長,需要60-90分鐘來分離提取SVF。另外一個我們關注的問題是SVF中的ASC(adipose-derived stem cell)的數(shù)量及功能在不同患者中并非一個固定參數(shù),因而使得最終脂肪保留率更加難以預測。近年來,與傳統(tǒng)脂肪移植技術相比,如何簡化脂肪移植流程、縮短手術時間但又不降低最終保留率成為整形外科醫(yī)生感興趣的話題。最新的研究逐漸把目光投向了吲哚美欣,其本質(zhì)是一種甾體抗炎藥,目前已廣泛應用于臨床。然而,吲哚美欣同時也是成脂基因PPAR-γ的配體,最新研究證實,吲哚美辛在體外可以促進脂肪干細胞的成脂并發(fā)現(xiàn)成脂基因表達明顯抬高。另有研究表明,吲哚美辛作為非甾體類抗炎藥,與間充質(zhì)干細胞(MSC)共同置入包裹性的水凝膠材料時可大大挽救移植細胞(MSC),可減少宿主免疫系統(tǒng)對移植細胞的侵襲,并通過調(diào)節(jié)局部微環(huán)境從而阻止促炎性細胞因子誘導的凋亡過程。這些數(shù)據(jù)提示了吲哚美欣與炎癥反應密切相關,與脂肪移植聯(lián)合應用可能提高最終保留率。因此,我們大膽假設添加吲哚美欣一方面可通過上調(diào)PPAR-γ的表達啟動成脂過程,另一方面,通過調(diào)控炎癥反應強度保護移植組織中的脂肪前體細胞,進而促進原本存在的ASC在成脂環(huán)境下進入成脂分化過程。為驗證該假說,本實驗組采取兩項獨立補充性實驗來探討吲哚美欣的促成脂效應。首先,為了檢測吲哚美欣促成脂效應的最適宜濃度,本實驗組將各個濃度梯度的吲哚美欣與條件培養(yǎng)基混合培養(yǎng)ASC并觀察最佳成脂分化組,同時檢測各添加組及對照組成脂基因表達情況以此獲得最適宜濃度。另外,建立小鼠的脂肪移植模型觀察體內(nèi)情況下各組的最終保留率。盡管吲哚美辛早已被FDA批準適用于臨床的多個方面,但作為藥物性添加劑應用于脂肪移植領域以及作為培養(yǎng)基添加劑培養(yǎng)人類ASC卻從未有此類研究報道,因而本實驗作為前瞻性實驗對于簡化脂肪移植流程和提高最終移植效果具有積極的探索性意義。方法1、人條件培養(yǎng)基及Zuk培養(yǎng)基的準備本次實驗研究使用患者腹部脂肪抽吸術后的廢棄游離脂肪,新鮮獲取的脂肪抽吸物用PBS清洗數(shù)次以洗去多余油滴和其他液體,然后以1:3的比例置于完全培養(yǎng)基(DMEM、10%胎牛血清、1%盤尼西林-鏈霉素、1%葡萄糖)內(nèi),在37℃、5%二氧化碳和95%的濕度條件下培養(yǎng)24 h。將孵育培養(yǎng)過后的培養(yǎng)基過濾以移除多余殘渣。將此過濾后的條件培養(yǎng)基分裝后放入-20℃冰箱凍存?zhèn)溆�。需制備促成脂作用的Zuk培養(yǎng)基作為陽性對照。按文獻所得,將DMEM,10%胎牛血清,0.5 mM異丁基甲基黃嘌呤(IBMX),1 μM地塞米松,10 μM胰島素,200 μM吲哚美辛,and 1%抗生素混合即為Zuk成脂培養(yǎng)基。同樣過濾后分裝、凍存?zhèn)溆谩?、人ASCs的分離提取和培養(yǎng)使用患者脂肪抽吸術后獲得的廢棄脂肪組織,將之充分剪碎后,用0.1%的I型膠原酶消化50min,期間充分震蕩使脂肪組織與膠原酶充分接觸。然后300g離心5min,棄上清液,用完全培養(yǎng)基將細胞重懸,用100 μm的尼龍網(wǎng)過濾后再以700g離心5min。棄上清液,用PBS徹底洗滌離心后的細胞,再次用完全培養(yǎng)基重懸后,分裝至培養(yǎng)皿培養(yǎng)。于次日更換新鮮培養(yǎng)液,將已貼壁90%的ASCs消化下來后,分裝并凍存于液氮以備隨時使用。3、吲哚美欣最佳濃度測定的體外實驗健康的人ASCs以2.0 × 104/孔接種至24孔板中,在完全培養(yǎng)基下培養(yǎng)至80%細胞聚集后,于第二日更換不同的條件培養(yǎng)液,依次更換為完全培養(yǎng)基(陰性對照)、Zuk培養(yǎng)基(陽性對照)和實驗組中的成脂誘導培養(yǎng)基。在實驗處理組中,以遞增濃度梯度的形式將吲哚美辛添加至上述已配置完好的條件培養(yǎng)液中,形成50,100,150,and 200 μ濃度的富含吲哚美辛的條件培養(yǎng)液,以確定吲哚美辛促成脂作用的最適宜濃度。同時,制備Zuk培養(yǎng)液與200 μ吲哚美辛的混合培養(yǎng)液,使吲哚美辛達到400μM的更高濃度。連續(xù)培養(yǎng)2周,每3天換一次培養(yǎng)基。所有分組為:完全培養(yǎng)基(Cm)、Zuk、條件培養(yǎng)基(Cd+50μM indo;Cd+100μM indo;Cd+150μM indo;Cd+200μM indo;uk+200μM indo)。4、油紅O染色及定量分析為檢驗ASC的分化程度,ASCs培養(yǎng)2周后進行油紅O染色鑒定。10%的福爾馬林液固定細胞,充分固定后洗滌,然后以油紅O溶液(稀釋于60%異丙醇溶液)染色1h后PBS多次清洗,然后加入1ml/孔的蘇木精染色液染色5min。移除蘇木精染液后,每孔加入1ml新鮮蒸餾水并至于光鏡下觀察拍照。為了將攝入油紅O染料的脂滴提取出來,每孔加入1ml異丙醇溶液,室溫下溫和震蕩15min,期間更換3次異丙醇溶液,最后每孔取250 μ L液體依次加入96孔板中,將96孔板置入分光儀中,取OD值為492 nm進行半定量分析測定。5、RT-PCR定量分析提取不同實驗組(Cm、Cd、Zuk、Cd+50μM indo;Cd+100μM indo;Cd+150μM indo;Cd+200μMindo;Zuk+200μM indo)中 ASCs 的 RNA。根據(jù)引物原則,測定成脂基因 PPAR-γ、CEBP-a、CEBP-β、FABP4、LPL 等,數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換以 2-△△CT相對表達量顯示,內(nèi)參基因設為18S。6、脂肪移植小鼠模型本實驗使用8周齡雌性C57BL/6小鼠,體重為30-40g.取35只小鼠腹股溝皮下脂肪墊,小心充分剪碎用以分離提取SVF。按Stillaert的方法提取SVF后,用PBS重懸細胞團,使最終細胞數(shù)量達到10,000個/200 μL。用1ml注射器將200μL的游離脂肪組織混合SVF/吲哚美辛或單獨注射于30只受體小鼠背部兩側(cè)皮下,使兩側(cè)皮下形成一脂肪團塊。因此體內(nèi)實驗部分可分為4組:(1)游離脂肪;(2)游離脂肪+SVF(細胞輔助的脂肪移植);(3)游離脂肪+200μMindo;(4)游離脂肪+200μMindo+SVF。移植后于2、4、12周取材觀察大體及組織學染色。7、大體觀測及組織學檢查脂肪移植術后2、4、12周時,將小鼠麻醉后準備取材。從小鼠背部正中線作一切口,充分暴露移植術區(qū),將移植的脂肪組織小心與周圍皮膚及基底肌肉組織剝離,并用排水法測量各自體積,同時檢測濕重。獲取的脂肪組織用4%的福爾馬林液固定過夜以備用于組織學檢查。將固定后的樣本用石蠟包埋,連續(xù)切片(5μm)后進行蘇木精-伊紅染色。8、免疫組化為鑒定樣本中脂肪細胞的活性,圍脂滴蛋白(perilipin)用以鑒定活性脂肪細胞。室溫下分別加入一抗(兔抗鼠圍脂滴蛋白rabbit anti-rat perilipin;Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA)1:300 染色 1h,PBS 沖洗三次后加入二抗(抗兔 EnVision Systems anti-rabbit,Dako,Glostrup,Denmark)染色 30mim,再次洗滌后加入增色劑3,3'-Diaminobenzidine(DAB)浸染2mim。CD31(platelet endothelial cell adhesion molecule)染色用以分析移植物樣本的血管化情況。同樣的,切片滴入一抗(rat anti-mouse;BD Biosciences,San Jose,CA,USA)1:100的比例染色1h,PBS沖洗3遍后加入二抗(Dako rabbit anti-rat biotinylated immunoglobulin)1:200的比例染色30min。再次充分洗滌后加入過氧化物酶檢測體系(ABC Elite;Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)增強染色30mim。上述染色完成后,所有切片進行蘇木精復染,脫水,DPX封片處理可待鏡下觀察。9、活性脂肪細胞的形態(tài)測定及血管化分析本實驗組使用計算機輔助立體檢測系統(tǒng)(MBF Bioscience,Williston,VT,USA)定量分析活性脂肪細胞及血管化情況。圍脂滴蛋白和CD31染色切片分別置于10×、20×放大物鏡下觀察。將全視野所見樣本邊緣描繪出來以16點網(wǎng)格疊加均分處理(400 μm × 400 μm),隨機選擇整體樣本的25%進行計數(shù)統(tǒng)計,任意陽性染色細胞正落在隨機技術點正中心時則計數(shù),反之則不計數(shù)。最終活性脂肪細胞和CD31陽性細胞的百分比則是所得陽性計數(shù)細胞與參與統(tǒng)計細胞的比值X100%。以上所有計數(shù)結(jié)果均由兩位統(tǒng)計員雙盲計數(shù)所得。10、統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準誤(Mean±SEM)表示。使用統(tǒng)計學軟件SPSS 13.0進行統(tǒng)計學處理。兩組以上的組間比較采用one-wayANOVA(Bonferroni事后兩兩比較)方差分析。P0.05視為有統(tǒng)計學差異。結(jié)果1、吲哚美辛以劑量遞增的方式促進ASCs向成熟脂肪細胞分化本實驗中,不同濃度的吲哚美辛均可促進hASC的成脂化過程。油紅O染色用以鑒別成熟脂肪細胞的分化程度。觀察發(fā)現(xiàn),誘導后7天細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,加入不同濃度吲哚美欣培養(yǎng)液誘導成脂時可在72h內(nèi)觀察到脂滴聚集�？傮w而言,經(jīng)過2周遞增濃度梯度成脂誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)后細胞的分化成熟程度也表現(xiàn)出劑量遞增模式,并且添加200μ indo誘導成脂培養(yǎng)基組脂滴最多,大致觀察與Zuk誘導成脂組無異。然而,在Zuk+200μMindo(400μ indo)組富含脂滴的成熟脂肪細胞的數(shù)量并不出現(xiàn)持續(xù)性的增高。這一現(xiàn)象與半定量分析油紅O溶液吸收率的結(jié)果一致。2、吲哚美辛在脂肪來源的條件培養(yǎng)基中上調(diào)成脂基因的表達200μM吲哚美辛聯(lián)合脂肪來源的條件培養(yǎng)基可有效誘導成脂化過程,培養(yǎng)后7天成脂基因PPAR-γ,CEBP-α,FABP4,LPL的表達顯著抬高,這一時期僅CEBP-β的表達并未出現(xiàn)明顯上抬,可能原因是CEBP-β的表達量上升出現(xiàn)于成脂化的較晚時期而非早期。其中,PPAR-γ的表達在吲哚美欣+脂肪來源的條件培養(yǎng)基組與Zuk培養(yǎng)組有同等程度的升高,這兩組表達量明顯高于陰性對照組和單獨添加吲哚美辛組,并與Zuk組無顯著性差異�？傮w而言,吲哚美欣在脂肪來源的條件培養(yǎng)基的存在下的所有基因表達均顯著提高,而單獨應用該藥物或單獨使用脂肪來源的條件培養(yǎng)基并不出現(xiàn)成脂基因明顯上臺表現(xiàn),提示吲哚美欣的促成脂效應只有在成脂微環(huán)境下才能得到最大化。3、移植組織的大體觀察和體積測量移植物在移植早期(2周和4周)出現(xiàn)了良好的包裹和血管化。SVF輔助脂肪移植組和吲哚美辛輔助脂肪移植組在所有時間點與單獨脂肪移植組相比體積均明顯增大。12周時計算移植體積終保留率,吲哚美辛處理組(不加SVF/加SVF)的體積終保留率顯著增加,分別為28.8%和35.76%,對照組為14.9%。吲哚美欣輔助脂肪移植組與SVF輔助脂肪移植組的體積終保留率無顯著差異。4、吲哚美欣促進移植脂肪細胞的活性但對血管化無影響通過圍脂滴蛋白鑒定脂肪細胞的活性�？梢杂^察到,4周時,吲哚美欣處理組活性脂肪細胞的形態(tài)學表現(xiàn)上具有更好的組織結(jié)構(gòu)的完整性�；钚灾炯毎陌俜直确謩e為吲哚美欣處理組(62%± 1.4%)、單獨脂肪移植組(對照組)(44%± 2.3%)(p=0.016),提示吲哚美欣可幫助延遲脂肪細胞的死亡或增強ASC的生存能力,這些都可促進移植晚期的成脂化過程。然而值得注意的是,吲哚美欣單獨處理組(62%± 1.4%)與SVF輔助移植組(60.9%± 1.9%)(p=0.138)在脂肪體積百分比上未見明顯不同。同樣,CD31染色在各組之間也未見明顯差異(p=0.290)。上述所有數(shù)據(jù)均由組織形態(tài)學分析定量計數(shù)4周時圍脂滴蛋白和CD31的陽性比率所得,該時間點由Kato等日本學者認為是脂肪再生發(fā)生的最有效階段,其研究亦觀察到圍脂滴蛋白陽性細胞在該時間點出現(xiàn)峰值。5、吲哚美欣處理后可提高脂肪再生的能力本實驗中我們意外發(fā)現(xiàn)了在移植組織中的間質(zhì)纖維組織和空泡周圍出現(xiàn)了一些小而圓的單房或多房細胞,其直徑一般小于30 μm并強烈表達圍脂滴蛋白,這揭示了移植后的成脂化現(xiàn)象,且對照組和吲哚美欣處理組均在4周時達到峰值。另有研究將直徑小于30 μm的小脂肪細胞定義為新生的脂肪細胞,而在我們的研究中,這一現(xiàn)象通常在2周和4周是可以觀察到,與此同時在對照組中卻極少觀察到此類小脂肪細胞的存在。正因為該類細胞具有脂肪新生的提示性意義,我們對此類細胞進行量化,結(jié)果顯示,代表著新生脂肪細胞的小脂肪細胞的數(shù)量在吲哚美欣處理組要明顯高于對照組,然后該類細胞的數(shù)量在兩組中均在12周時降低到較低水平,預示著脂肪再生的過程減緩。討論本研究原創(chuàng)性的特征是在不需額外添加SVF的情況下首次將吲哚美欣輔助用于脂肪移植中,在移植物體積和活性脂肪細胞的百分比上都與細胞輔助的脂肪游離移植組效果類似。無論是否添加SVF,吲哚美欣處理組在最終體積保留率上都明顯優(yōu)于對照組。多項研究表明,SVF輔助的脂肪游離移植能夠有效提高移植脂肪的最終體積,這可能是由于其增加了宿主來源的脂肪新生和血管化。然而,這項技術在標準化操作程序的安全性問題依然存有很大爭議。另外,SVF的表型的復雜性也使得其投入標準化使用更加困難,因此,尋找更簡便的方法最大化脂肪移植的終保留率將具有臨床吸引力。我們的體外實驗研究提供了一個從更層次探討藥物與ASCs相互作用機制的理解。首先,我們證實了吲哚美欣可以通過上調(diào)成脂基因激活成脂化過程。這也同時得到了 Styner等學者的支持,他們的研究發(fā)現(xiàn),吲哚美欣是通過上調(diào)PPARγ2的表達可激活并啟動前脂肪細胞和骨髓來源的MSC的成脂過程。具體來說,吲哚美欣作為PPARγ的配體促進了關鍵性成脂基因靶向的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。吲哚美欣同時又是非甾體消炎藥和環(huán)氧合酶2(COX2)抑制劑,可能通過抑制環(huán)氧合酶2的代謝產(chǎn)物——前列腺素2(PGE2)來阻斷Wnt信號通路,同時阻止成脂轉(zhuǎn)錄過程中的下游效應分子β連環(huán)蛋白的聚集。還有學者發(fā)現(xiàn)吲哚美欣與包裹性的水凝膠材料混合移植內(nèi)可以調(diào)節(jié)移植物的局部微環(huán)境并減輕促炎性細胞因子誘導的凋亡過程,因而提高并保護了移植材料內(nèi)MSC的活性。這在移植早期非常重要,此時期移植的脂肪在等待重新建立血管系統(tǒng)時受到宿主免疫系統(tǒng)的傷害。值得一提的是,通過局部施加抗炎藥物吲哚美欣模擬宿主免疫反應來提高整體移植脂肪的穩(wěn)定性可能會是一個可行策略。我們已經(jīng)證實吲哚美欣的促成脂效應是以劑量遞增方式表現(xiàn)的,根據(jù)我們的體外實驗選定了 200 μM的濃度作為體內(nèi)實驗的參考最適宜濃度。然而,由于大部分報道都是關于吲哚美欣口服劑量或主要聚焦于體外研究,至今仍缺乏關于吲哚美欣用于皮下注射的相關體內(nèi)研究。根據(jù)我們的研究,目前臨床初級方案仍是以注射時即單劑量聯(lián)合使用更為推薦。盡管連續(xù)口服吲哚美欣已被多數(shù)人耐受,但藥物輔助的脂肪移植技術較之細胞輔助的脂肪移植作為一種彌補或補充手段,其優(yōu)勢和局限性在臨床應用時仍需進一步評估。結(jié)論1、吲哚美欣的體外促成脂效應呈劑量遞增表現(xiàn)2、吲哚美欣可促進移植脂肪細胞的活性即提高移植組織的最終保留率,但對血管化無明顯影響3、吲哚美欣通過上調(diào)pPARγ等多項成脂基因的表達,并調(diào)控移植物局部炎癥及炎癥因子誘導的凋亡過程改善局部微環(huán)境來提高移植效果。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R622

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1 中國醫(yī)科院整形外科醫(yī)院 李發(fā)成 整理 本報記者 鄭穎t，

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