【摘要】：第一部分Prohibit in在糖基化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用研究研究背景目前,隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化,糖尿病(diabetes mellitus, DM)患者日益增多。糖尿病帶來的長(zhǎng)期的高血糖和代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥。糖尿病血管并發(fā)癥主要包括大血管并發(fā)癥和微血管并發(fā)癥,是糖尿病患者致死或致殘的主要原因之一。糖尿病是心肌梗塞、卒中的主要危險(xiǎn)因素之一,同時(shí)也是慢性腎病的一大危險(xiǎn)因素。糖尿病血管并發(fā)癥不僅嚴(yán)重影響著糖尿病患者的生活質(zhì)量和生存期限,也給國家和社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,探索糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制和尋找有效的治療方法是目前糖尿病研究的當(dāng)務(wù)之急。高血糖和血脂異常是糖尿病的兩大特點(diǎn)。高血糖引發(fā)血漿或組織中蛋白的非酶糖基化作用,產(chǎn)生不可逆的糖基化終末產(chǎn)物(glycation end-products, AGEs)。低密度脂蛋白(low-density lipoproteins, LDL)是血液中膽固醇的主要載體,LDL水平升高是已知的冠心病危險(xiǎn)因素。糖尿病患者體內(nèi)持續(xù)的高血糖狀態(tài)使LDL產(chǎn)生糖基化反應(yīng),已有證據(jù)顯示,糖尿病患者血漿中糖基化LDL的水平明顯增高,這也成為糖尿病患者高發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的主導(dǎo)因素之一。血管內(nèi)皮是位于血管管腔和血管壁之間的阻隔血流和其他組織的單細(xì)胞屏障,內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化的第一步。在動(dòng)脈粥樣硬化等病理狀態(tài)下,內(nèi)皮細(xì)胞被激活,其屏障作用受損,引起血管炎癥,進(jìn)而導(dǎo)致斑塊形成。近年來,絕大多數(shù)研究圍繞著糖基化LDL在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血栓形成、脂質(zhì)沉積和促炎癥等方面的作用,對(duì)于糖基化LDL是否能引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡卻鮮有研究。抑制素(prohibitins,PHBs)是一類具有高度同源性的蛋白,主要存在于線粒體內(nèi)膜上。PHBs有兩個(gè)同系物：Prohibitin (PHB,也被稱為PHB1)和prohibitin 2 (PHB2),兩者形成一個(gè)大的蛋白復(fù)合體,發(fā)揮多種與線粒體相關(guān)的生物功能。其中,PHB在調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老等多種生物進(jìn)程中起關(guān)鍵作用。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)PHB與AGEs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷有關(guān)聯(lián),本部分將進(jìn)一步研究PHB、糖基化LDL和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的內(nèi)在聯(lián)系。同時(shí),我們利用天然藥物葡萄籽原花青素B2 (grape seed procyanidin B2, GSPB2)進(jìn)行干預(yù),研究其與以上三者的相互作用。GSPB2是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最有效的天然類抗氧化藥物之一,具有多種生物活性,但其是否能對(duì)抗糖基化LDL損傷尚不明確。如果我們能尋找到GSPB2對(duì)抗糖基化LDL損傷的證據(jù),將對(duì)糖尿病血管并發(fā)癥的預(yù)防和治療有重要的意義,對(duì)其有效藥物的研發(fā)有極大的幫助。研究目的1.研究糖基化LDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響以及GSPB2的保護(hù)作用。2.研究PHB蛋白在糖基化LDL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用,以及GSPB2與兩者的相互作用。研究方法1.采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)作為細(xì)胞模型。正常對(duì)照組細(xì)胞(CC組)不做處理,損傷組細(xì)胞(glyLDL組)用50μg/ml糖基化LDL刺激HUVEC48小時(shí),天然藥物組細(xì)胞(glyLDL+GSPB2組)先用lOμmol/ml GSPB2預(yù)孵育2小時(shí),再加入50μg/ml糖基化LDL刺激HUVEC48小時(shí)。然后用CCK-8法、TUNEL法檢測(cè)HUVEC細(xì)胞的增殖率和凋亡率,用透射電鏡觀察各組之間細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變,Western Blot檢測(cè)PHB蛋白的表達(dá)。2.構(gòu)建PHB過表達(dá)質(zhì)粒和干擾siRNA,轉(zhuǎn)染入細(xì)胞�？召|(zhì)粒組細(xì)胞(glyLDL+V組)為轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C1的HUVEC,用50μg/ml糖基化LDL刺激48小時(shí)；過表達(dá)組細(xì)胞(glyLDL+VP組)為轉(zhuǎn)染PHB過表達(dá)質(zhì)粒的HUVEC,用50μg/ml糖基化LDL刺激48小時(shí)；陰性對(duì)照組細(xì)胞(NC組)為轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA的HUVEC;干擾組細(xì)胞(siPHB組)為轉(zhuǎn)染PHB siRNA的HUVEC;干擾+天然藥物組(siPHB+GSPB2組)為轉(zhuǎn)染PHB siRNA的HUVEC,用10μmol/ml GSPB2孵育48小時(shí)。CCK-8法、TUNEL法檢測(cè)HUVEC細(xì)胞的增殖率和凋亡率,用透射電鏡觀察各組之間線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變,Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率,以及Bax/Bcl-2比值、p-Akt的變化。研究結(jié)果1。糖基化LDL和GSPB2對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖率的影響與CC組細(xì)胞相比較,經(jīng)50μg/ml糖基化LDL刺激48小時(shí)后,HUVEC增殖率降低了近一半(p0.05)；而先用10μmol/L GSPB2將HUVEC細(xì)胞預(yù)孵育2小時(shí)后,再加用50μg/ml糖基化LDL刺激48小時(shí),其細(xì)胞增殖率的降低得到明顯改善(p0.05)2.糖基化LDL和GSPB2對(duì)HUVEC細(xì)胞凋亡的影響與正常細(xì)胞相比較,glyLDL組HUVEC細(xì)胞凋亡率大大提高(p0.05)且細(xì)胞核呈現(xiàn)固縮、斷裂的形態(tài),凋亡小體出現(xiàn)；而glyLDL+GSPB2組細(xì)胞凋亡明顯減輕(p0.05)。3.糖基化LDL和GSPB2對(duì)HUVEC細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響CC組HUVEC具有正常形態(tài)的線粒體,可見規(guī)則的板層狀嵴；glyLDL組的部分細(xì)胞線粒體的板層狀嵴結(jié)構(gòu)消失,取而代之的是線粒體中出現(xiàn)囊泡狀或高密度狀結(jié)構(gòu)；glyLDL+GSPB2組中線粒體的異常病變明顯減輕。4.糖基化LDL和GSPB2對(duì)HUVEC細(xì)胞PHB表達(dá)的影響Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),glyLDL組PHB蛋白表達(dá)量較CC組顯著降低(p0.05),而glyLDL+GSPB2組PHB蛋白的表達(dá)量明顯升高(p0.05)。5.PHB過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA的轉(zhuǎn)染效率PHB過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染入HUVEC細(xì)胞24小時(shí)及48小時(shí)后,VP組PHB的蛋白表達(dá)量顯著提升,超過2倍(p0.05),而V組PHB的蛋白表達(dá)量較CC組無明顯改變；siPHB組PHB的蛋白表達(dá)量下降60%以上(p0.05),而NC組PHB的蛋白表達(dá)量較CC組無明顯改變。6.PHB過表達(dá)質(zhì)粒和siPHB對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖率的影響相比較于glyLDL+V組,glyLDL+VP組細(xì)胞增殖率明顯升高(p0.05)；與NC組相比,siPHB組細(xì)胞增殖率明顯下降,siPHB+GSPB2組增殖率有所回升(p0.05)。7.PHB過表達(dá)質(zhì)粒和siPHB對(duì)HUVEC細(xì)胞凋亡的影響GlyLDL+V組TUNEL陽性細(xì)胞率明顯增高(p0.05), glyLDL+VP組凋亡細(xì)胞率有所下降(p0.05)；NC組與CC組細(xì)胞凋亡率無差別,siPHB組細(xì)胞凋亡率顯著提高(p0.05), siPHB+GSPB2組凋亡率有所下降(p0.05)。8.PHB過表達(dá)質(zhì)粒和siPHB對(duì)HUVEC細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響CC組細(xì)胞線粒體具有板層狀嵴,glyLDL+V組部分線粒體的板層狀嵴結(jié)構(gòu)消失,線粒體中出現(xiàn)囊泡狀或高密度狀結(jié)構(gòu),而glyLDL+VP組的線粒體異常得到明顯緩解；NC組與CC組細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)無明顯差別,siPHB組線粒體明顯異常,siPHB+GSPB2組線粒體異常有所改善。9.PHB、糖基化LDL和GSPB2對(duì)HUVEC細(xì)胞Bax/Bcl-2比值、p-Akt的影響GlyLDL組與CC組相比, Bax/Bcl-2比值、p-Akt表達(dá)量明顯升高(p0.05),glyLDL+GSPB2組兩者有所降低(p0.05); glyLDL+V組Bax/Bcl-2比值、p-Akt表達(dá)量顯著提高(p0.05),而glyLDL+VP組兩者有所下降(p0.05)；siPHB組比NC組Bax/Bcl-2比值、p-Akt表達(dá)量明顯增高(p0.05),而siPHB+GSPB2組兩者均降低(p0.05)。結(jié)論1.糖基化LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,GSPB2對(duì)其有保護(hù)作用。2.糖基化LDL可能通過下調(diào)PHB蛋白表達(dá)量誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,GSPB2可能通過抑制PHB蛋白表達(dá)量下調(diào)發(fā)揮其保護(hù)作用。第二部分葡萄籽原花青素B2對(duì)db/db小鼠胰腺的保護(hù)機(jī)制研究研究背景2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)是一種以高血糖和胰島素抵抗為特征的慢些代謝性疾病。T2DM的傳統(tǒng)治療方式主要集中在控制血糖上,包括非藥物治療和藥物治療。非藥物治療主要是飲食控制、運(yùn)動(dòng)鍛煉等方面的治療,藥物治療主要包括口服降糖藥和胰島素治療等。由于口服降糖藥效果差、毒副作用明顯,胰島素治療效果參差不齊等特點(diǎn),有一大部分患者血糖控制差強(qiáng)人意。長(zhǎng)期慢性的血糖升高逐步引發(fā)代謝紊亂、感染、血管病變等急、慢性并發(fā)癥,嚴(yán)重影響著糖尿病患者的生活質(zhì)量和生存周期。因此,對(duì)T2DM的致病機(jī)制和有效藥物的研究迫在眉睫。胰島素抵抗和胰島素分泌不足是T2DM發(fā)病機(jī)制中的兩個(gè)要素,雖然這兩個(gè)因素對(duì)不同患者所具有的重要性不同,胰島功能異常卻是貫穿至中的因素。胰島功能異常導(dǎo)致胰島素分泌不足,無法對(duì)抗胰島素抵抗,直接影響著糖尿病患者的疾病進(jìn)程和預(yù)后。多種因素導(dǎo)致胰島功能異常和胰島素抵抗。近年來,炎性作用在糖尿病胰腺病變中的作用吸引了越來越多的注意。研究發(fā)現(xiàn),在胰島損傷和胰島素抵抗的發(fā)展過程中,糖尿病患者體內(nèi)促炎癥因子不論在全身水平還是胰腺器官局部水平都有不同程度的提高,早期的T2DM的發(fā)病機(jī)制也與炎性作用有關(guān),抑制炎癥在某種程度上對(duì)糖尿病的治療發(fā)揮一定的作用。保護(hù)胰腺本身的功能使其保持對(duì)機(jī)體血糖變化的感知、及時(shí)調(diào)控胰島素分泌和釋放,是一種非常有效而且安全的糖尿病治療措施。GSPE是從葡萄籽中提取的一類黃酮類化合物,具有抗氧化應(yīng)激、抗炎癥、抗腫瘤及細(xì)胞保護(hù)等多種生物活性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),GSPE能有效改變胰腺microRNAs (miRNAs)的表達(dá),也能調(diào)節(jié)胰腺中與胰島素合成和分泌有關(guān)的蛋白的表達(dá)。但是對(duì)于其二聚體GSPB2對(duì)糖尿病胰腺的作用卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將利用T2DM模型鼠db/db小鼠為研究對(duì)象,探索GSPB2對(duì)糖尿病胰腺的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。研究目的1.研究GSPB2對(duì)db/db小鼠胰腺的保護(hù)作用。2.研究GSPB2對(duì)db/db小鼠胰腺保護(hù)作用的分子機(jī)制。研究方法T2DM模型鼠db/db小鼠為研究對(duì)象。16只雄性C57BLKS/J db/db小鼠及8只雄性C57BLKS/Jdb/m小鼠,均為7周齡大小,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開始正式實(shí)驗(yàn)。首先測(cè)定所有小鼠空腹體重,按照空腹體重?cái)?shù)值將16只C57BLKS/J db/db小鼠編號(hào),隨機(jī)選取8只作為糖尿病組(DM,n=8),其余8只作為GSPB2治療組(DMT, n= 8);8只C57BLKS/J db/m小鼠全部作為正常對(duì)照組(CC,n=8)。實(shí)驗(yàn)期間給予DMT組小鼠每日GSPB2 30mg/kg灌胃,給予DM組同等劑量的生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃10周,每周一次定期測(cè)量小鼠體重和進(jìn)食量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,將小鼠禁食12小時(shí)然后麻醉處死,采集各組小鼠血液測(cè)定空腹血糖(FBG)、AGEs、胰島素等指標(biāo)；取胰腺組織行HE染色觀察胰腺形態(tài)學(xué)改變；留取部分胰腺組織用于Western Blot,測(cè)定乳凝集素(milk fat globule epidermal growth factor-8, MFG-E8)以及炎性因子白介素-1β(interleukin, IL-1β)和NLRP3的表達(dá)。研究結(jié)果1.GSPB2對(duì)db/db小鼠體重和進(jìn)食量的影響相比較于CC組小鼠,DM組小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中表現(xiàn)出顯著的肥胖,體重明顯升高(p0.05)；加用GSPB2治療的DMT組小鼠,從第12周開始,其體重較DM組有明顯的下降(p0.05),但仍顯著高于CC組小鼠(p0.05)。DM組小鼠的進(jìn)食量在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中高于CC組小鼠(p0.05)；加用GSPB2治療后,其進(jìn)食量增長(zhǎng)速度減慢,第12～18周,DMT組小鼠進(jìn)食量較DM組明顯減少(p0.05)。2. GSPB2對(duì)db/db小鼠FBG和AGEs的影響DM組db/db小鼠的空腹血糖水平較CC組小鼠顯著升高(p0.05)；經(jīng)GSPB2 mg/kg/day灌胃10周后,DMT組小鼠FBG水平并無顯著下降。DM組小鼠的血漿AGEs水平較CC組明顯升高(p0.05)；而經(jīng)GSPB2治療的DMT組小鼠,其血漿AGEs水平有所降低(p0.05)。3. GSPB2對(duì)db/db小鼠胰腺形態(tài)的影響糖尿病病變?cè)缙?胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)能反射性引起胰島素水平增高和胰島細(xì)胞團(tuán)代償性增大,持續(xù)的胰島素升高和胰島增大能導(dǎo)致胰島β細(xì)胞耗竭,形成加重糖尿病的惡性循環(huán)。HE染色顯示：DM組小鼠胰腺形態(tài)表現(xiàn)為胰島膨大,胰島面積較CC組大大增加(p0.05)；而DMT組小鼠的胰島面積較DM組有所減小(p0.05),但仍大于正常對(duì)照組小鼠(p0.05)。4. GSPB2對(duì)db/db小鼠胰島素水平和HOMA-IR的影響DM組小鼠的血漿胰島素水平較CC組顯著升高(p0.05), DMT組小鼠的血漿胰島素水平有所下降(p0,05)。通過計(jì)算HOMA-IR發(fā)現(xiàn)：DM組小鼠的HOMA-IR水平較CC組明顯升高(p0.05),而DMT組小鼠的HOMA-IR水平有所回升(p0.05)。5. GSPB2對(duì)db/db小鼠胰腺M(fèi)FG-E8表達(dá)水平的影響Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：MFG-E8正常表達(dá)于CC組小鼠的胰腺中,與之相比,DM組小鼠胰腺中MFG-E8的表達(dá)顯著提高(p0.05),而DMT組小鼠胰腺的MFG-E8表達(dá)量有所降低(p0.05)。6. GSPB2對(duì)db/db小鼠胰腺IL-1β、NLRP3表達(dá)水平的影響Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與CC組小鼠相比,DM組小鼠胰腺中IL-1β、 NLRP3的蛋白表達(dá)量明顯增高(p0.05),而DMT組小鼠胰腺中IL-1β、NLRP3的蛋白表達(dá)量有所下降(p0.05)。結(jié)論1.GSPB2通過抗炎癥作用對(duì)糖尿病胰腺發(fā)揮保護(hù)作用。2. GSPB2對(duì)糖尿病胰腺的抗炎癥作用可能與調(diào)節(jié)MFG-E8、IL-1β和NLRP3的蛋白表達(dá)有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.2

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