【摘要】：【目的】 炎癥性腸�。╥nflammatory bowel disease, IBD）是一種多種病因引起的、異常免疫介導(dǎo)的腸道慢性及復(fù)發(fā)性炎癥，有終生復(fù)發(fā)傾向，潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis,UC）和克羅恩�。–rohn disease, CD）是其主要疾病類型[1]。近年來(lái)，我國(guó)炎癥性腸病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)，其發(fā)病機(jī)制可能是由多種因素相互作用所致，包括環(huán)境、遺傳、感染和免疫等[1]�；颊咧饕憩F(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹瀉、腹痛，體重下降以及血便等，但是，臨床上還沒(méi)有徹底的根治策略[1]。因此，如何根治IBD成為現(xiàn)下亟待解決的醫(yī)學(xué)問(wèn)題，迫切需要更多的基礎(chǔ)研究來(lái)探索其發(fā)病機(jī)制，從而找到一種新穎的治療方案，徹底改善患者的生活質(zhì)量。 近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸炎期間，選擇性激活雌激素受體β（ERβ）可以顯著減輕小鼠的癥狀，然而通過(guò)基因敲除的方法降低雌激素受體β的表達(dá)則會(huì)使結(jié)腸炎的癥狀進(jìn)一步惡化，因此提示，雌激素受體β激活可以在IBD模型中發(fā)揮抗炎抗傷害性感受的作用[2-4]。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)，在AOM或DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸癌模型中，激活雌激素受體β還可以發(fā)揮抗腫瘤作用[5-7]。盡管雌激素受體β激活已經(jīng)在結(jié)腸炎及與結(jié)腸相關(guān)的各種癌癥中發(fā)揮出了顯著的治療作用，但是其發(fā)揮作用的機(jī)制仍不完全清楚，需要進(jìn)一步的研究。 另一方面，與IBD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的還有一類重要的蛋白，即P2受體。近年來(lái)，許多研究證實(shí)，P2X受體的一種亞型——P2X7受體在IBD中起到了至關(guān)重要的作用。在IBD的進(jìn)展中，結(jié)直腸P2X7受體的表達(dá)顯著增高。這不僅可以誘導(dǎo)一些免疫細(xì)胞，如肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞等，釋放大量的炎性介質(zhì)，主要包括白介素類，白三烯類，以及TNF-α等[8-11]；還可以直接造成結(jié)直腸神經(jīng)元的的損傷及死亡，從而加速結(jié)直腸炎的惡化[12]。 為了進(jìn)一步研究在IBD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，雌激素與P2X受體表達(dá)與功能之間的關(guān)系，本課題主要應(yīng)用動(dòng)物行為學(xué)、Western Blot、Elisa及免疫組織化學(xué)等方法，研究了在IBD中，雌激素受體β激活發(fā)揮的作用，重點(diǎn)探討其與P2X7受體之間的關(guān)系。 【方法】 （一）大鼠結(jié)腸炎模型的建立 實(shí)驗(yàn)性結(jié)直腸炎通過(guò)結(jié)直腸內(nèi)注射30%的三硝基苯磺酸（TNBS）乙醇溶液（40mg/kg）進(jìn)行誘導(dǎo)。大鼠在輕度戊巴比妥鈉（2%，2mg/kg）麻醉狀態(tài)下，將一根直徑為6-Fr的塑料軟管經(jīng)肛門置入大鼠結(jié)直腸內(nèi)，至軟管前端距肛門為8cm處注入TNBS乙醇溶液。通過(guò)對(duì)大鼠體重、DAI評(píng)分、結(jié)直腸HE染色及結(jié)直腸MPO值的監(jiān)測(cè)，評(píng)估大鼠結(jié)直腸炎的嚴(yán)重程度。在注射TNBS乙醇溶液或生理鹽水后的第三天或第四天，分別給予不同組大鼠皮下注射生理鹽水、PPT、BBG、DPN及ERB-041，連續(xù)注射4天。 （二）組織學(xué)實(shí)驗(yàn) 取大鼠遠(yuǎn)端致炎結(jié)腸，在生理鹽水中清洗干凈后分別置于4%的多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定24-48小時(shí)，然后放入30%的蔗糖溶液中進(jìn)行脫水，直至沉入容器底部，進(jìn)行冰凍切片時(shí)取出。根據(jù)伊紅-蘇木精染色試劑盒說(shuō)明書中的步驟，對(duì)組織切片進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察拍照。 （三）Western Blotting 動(dòng)物處死后，分別取結(jié)直腸和DRG，高速勻漿后離心所得上清即為蛋白提取液。應(yīng)用BCA方法測(cè)定總蛋白濃度。分別配制10%的分離膠和4%的濃縮膠，經(jīng)電泳（恒壓100V，100分鐘）、轉(zhuǎn)膜（恒流300mA,90分鐘）、脫脂奶粉溶液封閉后，4℃中孵育一抗（P2X7抗體、雌激素受體β抗體、β-actin抗體）過(guò)夜。TBST快速洗膜，孵育相應(yīng)二抗（室溫，1小時(shí)），再次洗膜。最終，顯影拍照，并計(jì)算灰度值。 （四）ERβ mRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及慢病毒轉(zhuǎn)染 首先，根據(jù)雌激素受體β的序列（基因ID：25149）合成基因，然后，將上述合成的基因序列插入到質(zhì)粒中，進(jìn)行基因測(cè)序。將高純度的重組質(zhì)粒和慢病毒表達(dá)載體（LV-5-EF1a-GFP/Puro，帶有綠色熒光蛋白的慢病毒載體）共同轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，進(jìn)行病毒包裝和生產(chǎn)，提取病毒液，進(jìn)而濃縮和純化。用高質(zhì)量的病毒液感染293T細(xì)胞，通過(guò)定量PCR精確測(cè)定病毒滴度，用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。在注射TNBS乙醇溶液的前一天，用100ul的微量注射器將空白對(duì)照病毒（20ul）或含有ERβ的重組慢病毒（20ul）經(jīng)腹腔直接注射到大鼠結(jié)直腸壁中。 （五）結(jié)直腸MPO及炎性因子濃度的測(cè)定 將標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品分別加入48孔板中，每孔加入100ul，經(jīng)過(guò)洗板、加蒸餾水和一抗工作液、洗板、加酶標(biāo)抗體工作液、洗板、加底物工作液及終止液后，在酶標(biāo)儀中測(cè)出450nm處的吸光值，并作圖分析。根據(jù)樣品OD值計(jì)算出MPO及各種炎性因子的含量。 （六）免疫組織化學(xué) 大鼠深度麻醉后，灌注生理鹽水將大鼠體內(nèi)血液排凈，再注入相同量的4%多聚甲醛溶液對(duì)大鼠組織進(jìn)行固定，迅速取出結(jié)直腸，放置入新鮮的4%多聚甲醛溶液中再固定24-48小時(shí)，清洗后放置于30%的蔗糖溶液中，直至組織沉底。制作10um厚的冰凍切片，經(jīng)過(guò)洗片、抗原暴露、洗片、BSA封閉、洗片、孵育一抗（P2X7抗體、雌激素受體β抗體、Macrophage抗體）、洗片、孵育二抗、洗片等步驟后，封片拍照。 【結(jié)果】 1、與生理鹽水對(duì)照組相比，TNBS灌腸誘導(dǎo)結(jié)直腸炎的大鼠體重顯著降低，DAI評(píng)分顯著增高，髓過(guò)氧化物酶（MPO）濃度顯著升高，HE染色顯示結(jié)直腸腸壁結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)膜充血水腫，甚至缺失。Western Blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，致炎組大鼠結(jié)直腸與DRG神經(jīng)元中ERβ受體表達(dá)顯著降低；而結(jié)直腸中P2X7受體表達(dá)顯著增加，DRG神經(jīng)元中無(wú)明顯改變。Elisa結(jié)果顯示，致炎大鼠結(jié)直腸中的炎性因子，如TNF-α、IL-1β及IL-6，顯著升高，而IL-10無(wú)明顯改變。 2、當(dāng)應(yīng)用P2X7受體特異性拮抗劑BBG后，致炎大鼠的體重明顯恢復(fù)，DAI評(píng)分顯著降低，HE染色所示結(jié)直腸炎癥反應(yīng)明顯減輕。 3、當(dāng)應(yīng)用ERα受體特異性激動(dòng)劑PPT后，致炎大鼠體重降低更加明顯，DAI評(píng)分增加也更為顯著，HE染色所示結(jié)直腸炎癥反應(yīng)也明顯加重。 4、當(dāng)應(yīng)用含有ERβ受體的重組慢病毒后，致炎大鼠的體重明顯恢復(fù)，DAI評(píng)分顯著降低，HE染色所示結(jié)直腸炎癥反應(yīng)明顯改善。Western Blot結(jié)果顯示，應(yīng)用含有ERβ受體的重組慢病毒可以使致炎大鼠結(jié)直腸組織中的P2X7受體表達(dá)顯著降低，而DRG神經(jīng)元中的P2X7受體表達(dá)無(wú)明顯改變。 5、當(dāng)應(yīng)用ERβ受體特異性拮抗劑DPN和ERB-041后，致炎大鼠的體重明顯恢復(fù)，DAI評(píng)分顯著降低，HE染色所示結(jié)直腸炎癥反應(yīng)明顯改善。Western Blot結(jié)果顯示，應(yīng)用DPN和ERB-041可以使致炎大鼠結(jié)直腸組織中的P2X7受體表達(dá)顯著降低，而DRG神經(jīng)元中的P2X7受體表達(dá)則無(wú)明顯改變。Elisa結(jié)果顯示，應(yīng)用DPN和ERB-041可以使致炎大鼠結(jié)直腸中的炎性介質(zhì)，如MPO、TNF-α、IL-1β及IL-6，顯著降低，而IL-10無(wú)明顯改變。 6、結(jié)直腸組織中存在ERβ受體和P2X7受體的共表達(dá)，并且這種共表達(dá)存在于結(jié)直腸組織的巨噬細(xì)胞中。 【結(jié)論】 1、TNBS灌腸成功誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生結(jié)直腸炎。 2、P2X7受體參與了炎癥性腸病（IBD）的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，，抑制P2X7受體功能可以在IBD中發(fā)揮治療作用。 3、ERα受體參與了IBD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，ERα受體激活顯著加強(qiáng)IBD的腸道炎癥反應(yīng)。 4、ERβ受體激活或過(guò)表達(dá)對(duì)IBD的腸道炎癥反應(yīng)具有顯著的治療作用。這種作用可能通過(guò)降低結(jié)直腸中P2X7受體的表達(dá)，進(jìn)而減輕炎性介質(zhì)的釋放而完成。
[Abstract]:Purpose of the project

Inflammatory bowel disease ( IBD ) is a cause of multiple etiologies , abnormal immune - mediated intestinal chronic and recurrent inflammation , recurrent tendency , ulcerative colitis ( UC ) , and Crohn ' s disease ( CD ) are their major disease types . In recent years , the incidence of inflammatory bowel disease in China has been increasing year by year . Its pathogenesis may be caused by multiple factors , including environment , inheritance , infection and immunity . The patient mainly manifested as recurrent episodes of diarrhea , abdominal pain , loss of body weight , and bloody stool , but there was no radical cure strategy in clinic . Therefore , how to cure IBD has become an urgent medical problem , and there is an urgent need for more basic research to explore its pathogenesis , so as to find a novel treatment scheme to improve the quality of life of patients .

In recent years , it has been found that selective activation of estrogen receptor 尾 ( ER尾 ) during colitis can significantly reduce the symptoms of mice . However , it is suggested that estrogen receptor 尾 activation can play an anti - inflammatory and anti - inflammatory effect in IBD model . In addition , it is suggested that estrogen receptor 尾 activation can play an anti - inflammatory and anti - inflammatory effect in IBD model .

On the other hand , there are important proteins , namely P2 receptors , which are closely related to the development of IBD . In recent years , a number of studies have shown that a subtype of P2X receptors plays a crucial role in IBD . In the progression of IBD , the expression of the colorectal P2x7 receptor is significantly increased . This can not only induce some immune cells , such as mast cells , macrophages , helper T cells , and the like , and release a large amount of inflammatory mediators , including interleukin , leukotrienes , and TNF - 偽 , etc .
It can also directly cause damage and death of colorectal neurons , thus speeding up the deterioration of colitis .

In order to further study the relationship between estrogen and P2X receptor expression and function during the development of IBD , this study focused on the role of estrogen receptor 尾 activation in IBD , and focused on the relationship between estrogen receptor 尾 activation in IBD .

Methodology

( 1 ) Establishment of rat colitis model

The rats were anesthetized with 30 % trinitrobenzene sulfonic acid ( TNBS ) ethanol solution ( 40 mg / kg ) . The rats were anesthetized with mild sodium opental ( 2 % , 2 mg / kg ) .

( II ) Histological experiment

taking rat far - end inflammatory colon , cleaning in physiological saline , respectively placing in 4 % polyformaldehyde solution for fixing for 24 - 48 hours , then adding 30 % sucrose solution for dehydration until it sinks into the bottom of the container , and taking out the frozen section ; and performing staining on the tissue section according to the steps in the instruction of the eosin - threonine essence staining kit , and observing and taking pictures under a microscope .

( III ) Western Blotting

The total protein concentration was determined by the BCA method . The total protein concentration was determined by BCA method . The total protein concentration was determined by BCA method . After electrophoresis ( constant voltage 100mA , 100 min ) , membrane ( constant flow 300mA , 90 min ) , the membrane was incubated overnight ( constant current 300mA , 90 min ) , and the membrane was washed again at 4 鈩

本文編號(hào)：2123800