發(fā)布時(shí)間：2018-06-26 09:18

  本文選題：腦血管病 + 皮層神經(jīng)元��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目前,腦血管病已成為人類死亡的首要疾病,并且具有患病率高、致殘率高、死亡率高、復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn),其中腦梗死約占腦血管病的85%,因此研究和防治腦梗死具有極其重要的社會意義。據(jù)報(bào)道對腦梗死的的治療效果不盡如人意,腦梗死后神經(jīng)功能的損傷是患者致殘的主要原因。神經(jīng)元突起損傷是導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙的重要原因。如何促進(jìn)神經(jīng)元突起的生長是腦梗死后期治療的關(guān)鍵。腦梗死導(dǎo)致腦組織受到不同程度的損傷,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞,從而導(dǎo)致神經(jīng)功能受損。而神經(jīng)可塑性又可以促使形成新的豐富神經(jīng)網(wǎng)路結(jié)構(gòu)并能修復(fù)病變,從而改善缺血腦組織的神經(jīng)功能。因此研究給予藥物等加強(qiáng)神經(jīng)修復(fù)的作用顯得尤為重要。由于神經(jīng)元突起對于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的修復(fù)具有重要意義,因此,尋找能夠有效促進(jìn)神經(jīng)元突起生長的藥物,是當(dāng)前面臨的重要并且熱點(diǎn)課題。Sonic hedgehog(Shh)是分泌性糖蛋白因子,在胚胎和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、發(fā)育和分化中可調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化和軸突的形成。國內(nèi)外研究報(bào)道大鼠腦缺血中,Shh可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化和突起的形成發(fā)生來促進(jìn)神經(jīng)元可塑性,并且參與調(diào)控腦組織室下區(qū)神經(jīng)再生。然而,到目前為止,查閱大量文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)Shh蛋白對大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞神經(jīng)突起的作用及其機(jī)制仍未明確,仍需深入研究,這對增強(qiáng)神經(jīng)環(huán)路的研究具有重要意義。氧化應(yīng)激是腦梗死的重要病理生理機(jī)制,應(yīng)用氧化應(yīng)激模型有助于理解腦梗死的發(fā)病機(jī)理并開展相關(guān)治療。因此本課題利用皮層神經(jīng)元的氧化應(yīng)激模型來模擬腦梗死后皮層神經(jīng)元的損傷,研究Shh蛋白對氧化應(yīng)激下皮層神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用。線粒體是能量產(chǎn)生的主要場所,可在控制神經(jīng)重構(gòu)包括神經(jīng)分化、神經(jīng)突生長、神經(jīng)遞質(zhì)釋放以及樹突重構(gòu)等的基本過程中發(fā)揮著重要的作用。線粒體功能失調(diào)可能在腦梗死后神經(jīng)重塑中具有重要作用。調(diào)節(jié)腦梗死后線粒體的形態(tài)和功能可以介導(dǎo)神經(jīng)突起的生長,而神經(jīng)突起的生長是一個(gè)能量消耗的過程,需要足夠的能量供應(yīng),因此,能量的代謝和線粒體與神經(jīng)突起的生長高度相關(guān)。研究報(bào)道激活經(jīng)典的shh調(diào)節(jié)的信號通路可以增加線粒體活性。但是關(guān)于shh對于氧化應(yīng)激后皮層神經(jīng)元線粒體的影響報(bào)道較少,仍需深入研究。綜上所述,本研究首先利用孕15-18天c57bl/6胎鼠確立小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng)模型,其次利用此模型觀察shh蛋白對皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長的促進(jìn)作用,并探討其可能的影響機(jī)制,最后利用皮層神經(jīng)元的氧化應(yīng)激模型來模擬腦梗死,觀察shh對皮層神經(jīng)元的活性和神經(jīng)突起的作用,并從線粒體和能量代謝的角度探討shh對氧化應(yīng)激下皮層神經(jīng)元及其突起發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制。本研究分為三部分,現(xiàn)將各部分內(nèi)容概述如下。第一部分小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng)及細(xì)胞鑒定目的:通過對孕15-18天內(nèi)c57bl/6胎鼠皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng),掌握小鼠皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)方法,并觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué);利用免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞是否為神經(jīng)元細(xì)胞,以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。方法:c57bl/6雌雄小鼠交配獲取孕15-18天胎鼠,麻醉后斷頭取腦,于預(yù)冷1×hbss溶液的平皿中,在解剖顯微鏡下取出完整的大腦及小腦,夾除小腦,將大腦半球放入盛有預(yù)冷的1×hbss溶液的平皿中,在解剖顯微鏡下剝離腦膜,分離出皮層組織。將其剪碎放入15ml塑料離心管離心管內(nèi)加入3mlpapain消化液(新鮮配制),37°c孵育箱內(nèi)孵育15~30分鐘棄去papain消化液,加入3mlhibernatee洗滌,反復(fù)直至變成細(xì)胞懸液,200rpm離心3分鐘,棄去上清,加入含2%b27的neurobasal培養(yǎng)液,制成單細(xì)胞懸液,種植于poly-l-lysine處理過的培養(yǎng)皿中,于濕潤的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃,5%co2),并于不同時(shí)間點(diǎn)于顯微鏡下觀察所培養(yǎng)的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞的生長情況并記錄。取培養(yǎng)1天皮層神經(jīng)元,4%多聚甲醛固定,0.3%triton-x100破膜打孔作用15分鐘,10%驢血清室溫封閉45分鐘,加入抗鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronspecificenolase,nse)和兔抗鼠的膠質(zhì)細(xì)胞中間絲蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,gfap)一抗4℃過夜,然后加入驢抗小鼠fitc(1:200),驢抗兔tritc(1:200),37℃,1h,熒光封片劑后于熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)元并鑒定神經(jīng)元細(xì)胞。結(jié)果1皮層神經(jīng)元細(xì)胞剛接種時(shí)的細(xì)胞為圓形,2小時(shí)后開始貼壁,培養(yǎng)至6~8小時(shí)后,少數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞可見有明顯的細(xì)胞突起的生成。培養(yǎng)第24小時(shí)后,神經(jīng)元細(xì)胞胞體清晰、豐滿,胞體呈現(xiàn)錐體或星形,光暈的輪廓較明顯,細(xì)胞突起增長。培養(yǎng)第2天,細(xì)胞胞體增大,更清晰,突起明顯變長,而且突起之間形成了一定的聯(lián)系。培養(yǎng)第3天,絕大多數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞的突起已經(jīng)相互連接,并形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。2本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫熒光法檢測發(fā)現(xiàn)nse標(biāo)記的神經(jīng)元細(xì)胞在視野中出現(xiàn)較多,并顯示出完整的神經(jīng)元形態(tài),而且細(xì)胞胞體豐滿,突起生長較多;視野中未發(fā)現(xiàn)gfap標(biāo)記的膠質(zhì)細(xì)胞。結(jié)論1本實(shí)驗(yàn)利用無血清培養(yǎng)法成功建立了小鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng)模型,具有穩(wěn)定性高、純度高和存活率高的皮層神經(jīng)元細(xì)胞,是一種研究神經(jīng)科學(xué)的理想模型。2本試驗(yàn)利用免疫熒光法對所培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞的鑒定結(jié)果提示對胎鼠腦皮層細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)獲得的神經(jīng)元細(xì)胞存活率高,純度高,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下了良好的基礎(chǔ)。第二部分shh蛋白對皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的作用及與bdnf機(jī)制研究目的:觀察shh蛋白對小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞神經(jīng)突起的生長作用,并探討shh蛋白對皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的作用及其相關(guān)的可能機(jī)制。方法:取孕15-18天的c57bl/6小鼠的原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分為對照組、不同濃度的shh(5,50,500ng/ml)組、shh信號通路抑制劑環(huán)耙明(cyclopamine,cpm)組、cpm+shh組和酪氨酸激酶抑制劑k252a+shh組。抑制劑在加入shh蛋白前30min提前加入,藥物作用于神經(jīng)元細(xì)胞24小時(shí)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用免疫熒光法檢測神經(jīng)元細(xì)胞中shh受體(ptch)的表達(dá);β-tubulin免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法測定shh對皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長長度;rt-qpcr法檢測神經(jīng)元細(xì)胞中shh和ptch基因水平表達(dá);rt-qpcr和western-bloting法檢測神經(jīng)元細(xì)胞中bdnf基因和蛋白水平表達(dá);免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法測定神經(jīng)元神經(jīng)突bdnf的含量;按照bdnf試劑盒說明書采用elisa法測定神經(jīng)元培養(yǎng)液中bdnf的含量。結(jié)果1首先證實(shí)shh受體—ptch在皮層神經(jīng)元細(xì)胞存在,提示shh蛋白可能對調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)元神經(jīng)突的生長具有生物學(xué)效應(yīng)。250ng/ml和500ng/ml的shh蛋白組能夠明顯促進(jìn)神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長(p0.05)。特別有趣的是,50ng/ml的shh蛋白組對神經(jīng)突起的生長的促進(jìn)作用更加明顯,因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用shh濃度為50ng/ml進(jìn)行。3與單用shh蛋白組相比,shh和cpm共同作用后能夠顯著降低神經(jīng)突起的長度(p0.05),提示shh介導(dǎo)的神經(jīng)突起的生長作用部分能被cpm阻斷。4shh蛋白干預(yù)均能夠誘導(dǎo)細(xì)胞中shh和ptch的基因表達(dá)增加,給予cpm后,shh誘導(dǎo)細(xì)胞中shh和ptch基因表達(dá)增加均部分被抑制(p0.05)。5shh蛋白干預(yù)能夠使神經(jīng)元細(xì)胞bdnf在mrna和蛋白水平上增加,給予cpm后,shh介導(dǎo)的bdnf的表達(dá)增加被抑制(p0.05)。6shh蛋白干預(yù)能夠使神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)突起中bdnf表達(dá)增加,與cpm聯(lián)用后,這種增加部分被抑制。7shh蛋白干預(yù)能夠使細(xì)胞培養(yǎng)液中bdnf的含量也增加,給予cpm后,細(xì)胞培養(yǎng)液中bdnf的含量增加也被抑制(p0.05)。8與單用shh組相比,k252a和shh聯(lián)合作用組對皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長長度有所降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:本試驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞中存在shh受體-ptch,并且shh蛋白能夠促進(jìn)皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長,shh蛋白可能部分通過激活shh信號通路實(shí)現(xiàn)其對腦皮層神經(jīng)元的神經(jīng)突起的促生長作用;此外shh蛋白還可能通過促進(jìn)bdnf的表達(dá)來發(fā)揮其對神經(jīng)突起的促生長作用,最終實(shí)現(xiàn)shh蛋白的神經(jīng)保護(hù)作用。第三部分shh蛋白對氧化應(yīng)激下皮層神經(jīng)元活性和神經(jīng)突起的作用及其線粒體機(jī)制研究目的:觀察shh蛋白對氧化應(yīng)激下小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞的活性影響和神經(jīng)突起的生長作用的影響,觀察shh蛋白對氧化應(yīng)激下皮層神經(jīng)元細(xì)胞中活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)、超氧化物岐化酶(superoxidedismutase,sod)及丙二醛(malondialdehyde,mda)的影響,并檢測shh蛋白對氧化應(yīng)激下線粒體形態(tài)和功能的影響以及對能量代謝和線粒體氧化呼吸鏈復(fù)合物酶ii的影響,進(jìn)而探討shh蛋白對氧化應(yīng)激下皮層神經(jīng)元的活性和神經(jīng)突起的作用及其可能的線粒體和能量代謝機(jī)制。方法:取孕15-18天c57bl/6小鼠的胎鼠,取其皮層組織,進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)。皮層神經(jīng)元培養(yǎng)24小時(shí)后,加入100umh2o2處理2h,然后換液繼續(xù)以神經(jīng)元培養(yǎng)液培養(yǎng),體外模擬腦缺血模型。實(shí)驗(yàn)分為對照組、h2o2組、h2o2+shh組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用cck-8法檢測shh蛋白對氧化應(yīng)激下皮層神經(jīng)元的細(xì)胞活性的影響;利用β-tubilin免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法測定shh蛋白對氧化應(yīng)激下皮層神經(jīng)元神經(jīng)突的長度的作用;western-bloting檢測各組皮層神經(jīng)元細(xì)胞中g(shù)ap-43蛋白水平表達(dá)和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法測定各組中皮層神經(jīng)元細(xì)胞gap-43的表達(dá);利用用活性氧檢測試劑盒測定各組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的ros的表達(dá)變化,結(jié)果為所檢測得的熒光值與對照組的熒光度的比值(%ofcontrol)表示;根據(jù)sod和mda說明書的說明步驟測定shh蛋白對各組細(xì)胞中sod活性和mda的含量表達(dá)變化;通過透射電鏡觀察各組中皮層神經(jīng)元線粒體形態(tài)的改變;利用線粒體膜電位檢測試劑盒(jc-1)檢測各組神經(jīng)元細(xì)胞線粒體膜電位(mmp)的變化情況。利用atp活性試劑盒檢測各組皮層神經(jīng)元atp活性的變化情況;利用線粒體呼吸鏈復(fù)合物酶ii試劑盒分析各組神經(jīng)元細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物酶ii活性。結(jié)果1cck-8法檢測結(jié)果h2o2能夠降低神經(jīng)元細(xì)胞的活性,當(dāng)加入shh蛋白后,細(xì)胞活性的能力增強(qiáng),50,500ng/ml的shh能顯著促進(jìn)氧化應(yīng)激的神經(jīng)元細(xì)胞存活率。2與對照組相比,神經(jīng)元受到h2o2作用后,其神經(jīng)突起的生長損傷(p0.05),而在h2o2作用后加用shh蛋白后神經(jīng)元神經(jīng)突的生長得到一定程度的恢復(fù)(p0.05),結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。應(yīng)用免疫熒光和westernblot法檢測細(xì)胞中g(shù)ap-43的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示h2o2作用于神經(jīng)元細(xì)胞后gap-43的表達(dá)降低,而加入shh蛋白后其表達(dá)升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),進(jìn)一步證實(shí)shh蛋白能改善氧化應(yīng)激損傷的皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長。3與對照組相比,h2o2作用于皮層神經(jīng)元后,其細(xì)胞內(nèi)ros含量升高,sod活性下降,mda含量升高,而給予shh蛋白干預(yù)后,神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS含量下降,SOD活性上升,MDA含量下降(P0.05)。4透射電鏡顯示,與對照組相比,H2O2作用后神經(jīng)元內(nèi)的線粒體損傷嚴(yán)重,線粒體腫脹,空泡化,并且結(jié)構(gòu)也破損。當(dāng)加入Shh蛋白干預(yù)后,線粒體形態(tài)得到一定程度的恢復(fù),空泡化和腫脹的線粒體減少。MMP結(jié)果顯示,與對照組相比,H2O2作用于皮層神經(jīng)元后,神經(jīng)元細(xì)胞的MMP下降,而給予Shh蛋白干預(yù)后,神經(jīng)元細(xì)胞的MMP較之上升(P0.05)。5 ATP檢測結(jié)果顯示,H2O2組細(xì)胞的ATP的量與對照組相比明顯下降,Shh蛋白干預(yù)后,神經(jīng)元細(xì)胞的ATP量有所好轉(zhuǎn),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6 H2O2作用于神經(jīng)元后線粒體呼吸鏈復(fù)合物酶II的活性下降,而在氧化應(yīng)激后給予Shh蛋白治療后,其活性較H2O2組好轉(zhuǎn)(P0.05)。結(jié)論:本試驗(yàn)利用氧化應(yīng)激模型模擬腦缺血狀態(tài),研究發(fā)現(xiàn)Shh蛋白能促進(jìn)氧化應(yīng)激的皮層神經(jīng)元的存活和神經(jīng)突起的生長。Shh蛋白可能通過降低ROS,上調(diào)SOD的活性,減少M(fèi)DA含量,也通過修復(fù)線粒體復(fù)合物酶II的活性逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的能量的生成障礙,并能保護(hù)皮層神經(jīng)元的線粒體形態(tài)和功能對氧化應(yīng)激狀態(tài)下的神經(jīng)元起到保護(hù)和營養(yǎng)(促神經(jīng)突起生長)的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R743.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2069898