發(fā)布時間：2018-06-24 18:38

  本文選題：主動脈夾層 + miR-22��； 參考：《第二軍醫(yī)大學》2016年博士論文

【摘要】：研究目的:明確miR-22對血管平滑肌細胞作用及其在主動脈夾層發(fā)病中的作用及調(diào)控機制。研究方法:1.在符合倫理要求前提下,收集正常捐獻者主動脈組織8例,主動脈夾層患者主動脈10例;提取主動脈組織總RNA進行qRT-PCR檢測miR-22表達含量;主動脈組織冰凍包埋切片,通過miRNA熒光原位雜交和細胞免疫熒光共定位檢測miR-22在主動脈組織中分布差異;2.轉(zhuǎn)基因Tg(Flik1∶egfp)斑馬魚系胚胎單細胞時期顯微注射MO-22,于注射后斑馬魚20phf、24phf、30phf收集斑馬魚胚胎各20枚提取總RNA,qRT-PCR檢測miR-22表達變化;分別于斑馬魚24phf、30phf在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚節(jié)間血管及背動脈生長情況;3.構(gòu)建miR-22上調(diào)和下調(diào)腺病毒,GCP觀察法確定腺病毒轉(zhuǎn)染最佳MOI值,腺病毒轉(zhuǎn)染HASMC48小時后,提取HASMC總RNA,qRT-PCR檢測miR-22表達變化;miR-22上調(diào)和下調(diào)腺病毒轉(zhuǎn)染HASMC,于轉(zhuǎn)染后0h、12h、24h、36h、48h用CCK-8法檢測HASMC增殖變化,轉(zhuǎn)染后36h顯微鏡下拍照計數(shù),統(tǒng)計HASMC增殖;miR-22上調(diào)和下調(diào)腺病毒轉(zhuǎn)染HASMC48小時后利用annexin V-APC及7-AAD雙染色后流式細胞儀檢測HASMC凋亡;利用生物信息學軟件預(yù)測miR-22靶基因;分別提取正常捐獻者與主動脈夾層患者主動脈組織總蛋白,miR-22上調(diào)和下調(diào)腺病毒轉(zhuǎn)染HASMC 72小時后提取細胞總蛋白,Western blot檢測miR-22預(yù)測MAPK14表達變化;si RNA沉默MAPK14的表達,MAPK14 si RNA與Anti-miR-22共同轉(zhuǎn)染HASMC,annexin V-APC及7-AAD雙染色后流式細胞儀檢測HASMC凋亡,與對照組比較MAPK14和Anti-miR-22對HASMC凋亡的作用;4.3周齡FVB小鼠普通飲食喂養(yǎng),飲用水中添加β-氨基丙腈1g/kg/day,2周后,尾靜脈注射miR-22 Agomir/antagomir15OD/只,持續(xù)喂養(yǎng)至小鼠7周齡時,局麻下小鼠背部皮下植入血管緊張素Ⅱ微泵(1μg/kg/min)24小時,小鼠注射大劑量苯巴比妥麻醉后處死,解剖分離主動脈根部至髂總動脈小鼠主動脈,大體標本觀察統(tǒng)計小鼠主動脈夾層發(fā)生率,主動脈分為3段,10%福爾馬林固定石蠟包埋切片,分別提取RNA、蛋白;通過qRT-PCR檢測miR-22表達含量;Western blot檢測MAPK14表達變化;小鼠主動脈石蠟切片HE染色測量小鼠主動脈中膜厚度(MT)、管腔直徑(LD),計算MT/LD;EVG染色比較小鼠主動脈彈力纖維變化,Masson染色檢測小鼠主動脈膠原纖維變化。結(jié)果:1.qRT-PCR驗證了miR-22在主動脈夾層患者主動脈組織中含量表達下調(diào)(P0.05),通過熒光原位雜交及主動脈細胞共定位,發(fā)現(xiàn)miR-22在主動脈夾層患者主動脈平滑肌細胞中表達顯著下調(diào);2.通過對轉(zhuǎn)基因Tg(Flik1∶egfp)斑馬魚系胚胎單細胞時期顯微注射MO-22,發(fā)現(xiàn)MO-22可使斑馬魚20-30phf時間內(nèi)miR-22表達下調(diào)(P0.05);miR-22下調(diào)可顯著抑制斑馬魚24phf節(jié)間血管的生長,在斑馬魚30phf時MO-22可顯著抑制斑馬魚背動脈的生長;3.Ad-miR-22和Anti-miR-22轉(zhuǎn)染HASMC的最佳MOI值為100;Anti-miR-22轉(zhuǎn)染HASMC 36h后可抑制HASMC的增殖,Ad-miR-22在轉(zhuǎn)染HASMC 36h時可促進HASMC的增殖;Anti-miR-22較其對照組相比促進HASMC的凋亡,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05);生物信息學預(yù)測MAPK14是miR-22的潛在靶基因,通過提取人主動脈夾層患者主動脈組織和HASMC蛋白進行Western blot證明MAPK14符合miR-22的靶基因生物學功能,與miR-22在主動脈夾層患者主動脈組織中的表達相反,MAPK14在主動脈夾層患者組織中表達上調(diào),且在HASMC中,Ad-miR-22可使MAPK14表達下調(diào),Anti-miR-22則促進MAPK14的表達;通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)直接證實MAPK14是miR-22的靶基因;利用si RNA沉默HASMC MAPK14的表達,同時通過腺病毒抑制HASMC中miR-22的表達,發(fā)現(xiàn)HASMC的凋亡受到顯著抑制;4.通過qRT-PCR證明Ago-miR-22可顯著促進小鼠主動脈miR-22的表達,Antago-miR-22較對照組相比抑制小鼠主動脈miR-22的表達(P0.05);收集小鼠主動脈提取組織總蛋白,Western blot證明Ago-miR-22組小鼠主動脈MAPK14表達上調(diào),而Antago-miR-22組小鼠主動脈組織MAPK14表達下調(diào)。通過對小鼠主動脈解剖進行大體標本觀察統(tǒng)計,夾層造模組、agomir-22組、agomir NC組5/18(27.8%),antagomir-22組、antagomir NC組小鼠主動脈夾層發(fā)生率分別為6/18(33.3%)、12/18(66.7%)、11/17(64.7%)、7/18(38.9%),經(jīng)統(tǒng)計分析,agomir-22組較其對照組相比可顯著抑制小鼠主動脈夾層的發(fā)生(P0.05),antagomir-22組較其對照組相比主動脈夾層發(fā)生無統(tǒng)計學差異(P=0.1267);夾層造模組、agomir-22組、agomir NC組、antagomir-22組、antagomir NC組五組的中膜厚度值分別是74.76±4.59μm、118.94±5.76μm、81.23±3.05μm、65.59±3.74μm、94.76±4.02μm;主動脈管腔直徑分別是2.54±0.21mm、1.55±0.11mm、3.12±0.2mm、3.74±0.2mm、1.55±0.11mm、2.94±0.14mm;miR-22上調(diào)可使小鼠主動脈MT增大,LD降低,MT/LD增大,而miR-22下調(diào)使小鼠主動脈MT降低,LD增大,MT/LD降低;agomir-22組較對照相比增加小鼠主動脈彈力纖維,antagomir-22組較對照組相比使小鼠主動脈彈力纖維減少,結(jié)構(gòu)紊亂,甚至斷裂;miR-22上調(diào)可增加小鼠主動脈膠原纖維,而miR-22下調(diào)導致小鼠主動脈中外膜膠原纖維降低。結(jié)論:1.miR-22在主動脈夾層患者主動脈平滑肌細胞中表達顯著下調(diào);2.MO-22可顯著抑制斑馬魚24phf節(jié)間血管生長并抑制30phf斑馬魚背動脈生長;3.Anti-miR-22抑制HASMC增殖,Ad-miR-22可促進HASMC增殖,Anti-miR-22通過上調(diào)miR-22靶基因MAPK14的表達促進HASMC凋亡;4.MAPK14在小鼠主動脈miR-22上調(diào)組中表達升高,而在miR-22下調(diào)組小鼠主動脈中表達降低;miR-22可顯著抑制小鼠主動脈夾層的發(fā)生,miR-22升高小鼠主動脈MT/LD,增加彈力纖維及膠原纖維使小鼠主動脈中膜結(jié)構(gòu)增強而抑制主動脈夾層發(fā)生;而miR-22下調(diào)則使小鼠主動脈miR-22下調(diào)通過降低主動脈MT/LD,減少并破壞彈力纖維結(jié)構(gòu),降低膠原纖維含量使主動脈管壁結(jié)構(gòu)薄弱,進而導致主動脈夾層的發(fā)生。
[Abstract]:The effects of miR - 22 on vascular smooth muscle cells and the role of miR - 22 in the pathogenesis of aortic dissection were studied . The expression of miR - 22 in aortic dissection was regulated by Western blot . The results showed that the expression of miR - 22 in aortic dissection was downregulated by Western blot ( P0.05 ) . 鍙戠幇HASMC鐨勫噵浜″彈鍒版樉钁楁姂鍒，

本文編號：2062538