本文選題：環(huán)(組氨酸-脯氨酸)二肽 + 玉米蛋白��； 參考：《吉林農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文

【摘要】：組氨酸-脯氨酸環(huán)二肽(cyclo(His-Pro),CHP)是由脯氨酸和組氨酸通過一對互補的肽鍵互相連接而形成的一種環(huán)二肽。藥理學研究發(fā)現(xiàn)CHP具有緩解酒精麻醉、對抗某些中樞抑制藥物的毒副作用,保護神經(jīng)元、降血糖、抗氧化等生理功能,加之其抗酶解能力強,生物利用度高,這就有可能使之成為治療某些疾病,特別是吸毒、嗜酒及糖尿病有效的一種短肽類藥物。糖尿病是當今威脅人類健康的主要慢性代謝疾病之一,全世界有4.5億人正遭受著糖尿病及其并發(fā)癥的折磨。目前臨床上治療糖尿病的藥物以西藥(如α-葡萄糖苷酶抑制劑阿卡波糖、格列美脲、二甲雙胍、胰島素制劑等)為主,雖然能不同程度調血糖水平,但長期用藥會出現(xiàn)肝臟毒性等不良反應,且易產(chǎn)生“繼發(fā)失效”,而且這些藥物不能抑制或治療對糖尿病并發(fā)癥。因此尋找到一種療效好、毒副作用低的降血糖藥物或功能因子,成為糖尿病臨床治療的當務之急。具有降血糖活性的天然產(chǎn)物亦成為研究的熱點。本研究以玉米蛋白粉為原料,利用可控酶解技術、高溫高壓合成技術和微波合成技術制備CHP,綜合運用一系列先進的分離技術手段對得到的酶解液進行分離純化,并采用液質聯(lián)用、傅里葉紅外光譜、核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance,NMR)等技術對分離得到的目標肽進行結構鑒定。最后考察了玉米CHP對實驗型糖尿病小鼠血糖調節(jié)的影響,并初步探討了降血糖機制,有望進一步開發(fā)成降血糖藥物或功能性保健食品。與化學合成法相比,本研究的CHP制備方法具有反應路線短、原料廉價易得、后處理簡單、生產(chǎn)周期短、綠色環(huán)保等優(yōu)勢,適于在工業(yè)化生產(chǎn)中推廣。我國玉米蛋白資源豐富,利用率低,本研究的成果如能在實際中得以順利實施,不僅能提高玉米蛋白的附加值,有效解決玉米淀粉加工中廢棄物所造成的環(huán)境污染問題,而且能推進CHP降血糖類藥物和保健品開發(fā)的進程,對開拓糖尿病及并發(fā)癥防治的新途徑以及新資源的利用具有重要的意義。研究內(nèi)容及結果如下:1、采用連續(xù)累進提取法提取和純化玉米蛋白,產(chǎn)物中蛋白質組分主要為醇溶蛋白(zein)、谷蛋白-1(G1-glutelin)和谷蛋白-2(G2-glutelin),分別占蛋白總量的51.33%、14.65%和19.74%。氨基酸分析結果表明G1-glutelin和G2-glutelin中組氨酸和脯氨酸含量較高。電泳分析結果顯示三種提取蛋白均不是單一組分,而是由多條亞基組成。將三種蛋白的主要亞基帶從SDS-PAGE電泳凝膠上切割下來,經(jīng)胰蛋白酶水解后采用納升級液相色譜串聯(lián)質譜技術(nanoscale liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry,Nano LC-MS/MS)進行鑒定,結果表明G1-glutelin和G2-glutelin中含有較多的組氨酸-脯氨酸(His-Pro)和脯氨酸-組氨酸(Pro-His)序列,是酶解制備CHP前體二肽的理想底物蛋白。2、選用四種常用的蛋白酶水解玉米谷蛋白,通過比較各種單酶和雙酶水解產(chǎn)物水解度和CHP前體二肽得率的差異,得到酶解制備CHP前體二肽的最佳水解用酶為堿性蛋白酶-風味蛋白酶。采用正交實驗對其酶解條件進行優(yōu)化,得到的最佳酶解條件為:底物濃度40mg/mL,先加入11000 U/g的堿性蛋白酶水解7h,再加入17000U/g的風味蛋白酶,在pH 7.5、55℃下水解6h,在此條件下得到的酶解液中CHP前體二肽得率為7.38mg/g。3、綜合運用醇沉、陰離子交換層析、凝膠層析及兩步反相-高效液相色譜(reverse phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)技術,在定量跟蹤的基礎上從玉米蛋白酶解液中分離富集CHP前體二肽,最終得到的組分Q-A2-a-I中CHP前體二肽含量為98.15%。氨基酸分析表明組分Q-A2-a-I僅含有組氨酸和脯氨酸兩種氨基酸,其物質的量之比為組氨酸:脯氨酸=1:1.18;綜合運用超高效液相色譜串聯(lián)質譜技術(ultra high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)及計算最終鑒定出Q-A2-a-I中目標肽的氨基酸序列結構為His-Pro和Pro-His,分子量分別為252.6Da和252.7Da。采用1H-NMR和13C-NMR對Q-A2-a-I進行結構鑒定,結果表明組分Q-A2-a-I的結構為目標化合物。4、分別將高溫高壓合成技術和微波合成技術應用于玉米CHP的制備,分別從CHP前體二肽和玉米蛋白水解物出發(fā),以水為溶劑,分別采用高溫高壓和微波技術對其進行環(huán)化,制備玉米CHP。通過單因素試驗優(yōu)化,得到CHP前體二肽高溫高壓環(huán)化的最優(yōu)工藝條件為:反應壓力0.2MPa,反應溫度120℃,反應時間6h,底物濃度為20mg/mL,溶液pH值為8.0,在此條件下對CHP前體二肽純品進行環(huán)化,得到的反應得率為93.25%;若從玉米蛋白水解物出發(fā),其高溫高壓環(huán)化的最優(yōu)工藝條件為:反應壓力0.2MPa,反應溫度120℃,反應時間6.5h,底物濃度30mg/mL,溶液pH值8.0,在此條件下,玉米蛋白水解物中的His-Pro和Pro-His線性二肽可直接發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化,環(huán)化反應得率為91.87%;CHP前體二肽微波環(huán)化的最佳條件為:單位體積的溶液吸收的微波能(即微波功率密度)為9W/mL,反應時間45min,底物濃度25mg/mL,溶液pH值8.0,在此條件下環(huán)化反應得率為76.42%。玉米蛋白水解物微波環(huán)化的最佳條件為:微波功率密度9W/mL,反應時間55min,底物濃度30mg/mL,溶液pH值8.0,在此條件下環(huán)化反應得率為73.59%。綜合比較高溫高壓環(huán)化法、微波環(huán)化法和乙醇回流法,可以得出利用高溫高壓環(huán)化法一步合成CHP,不僅反應得率最高,反應時間相對較短,而且具有工藝簡單、生產(chǎn)成本低、綠色環(huán)保等優(yōu)點,適合玉米CHP的大批量生產(chǎn)。5、以高溫高壓環(huán)化后的玉米蛋白酶解物為原料,采用離子交換色譜、凝膠過濾色譜和半制備型RP-HPLC技術從酶解液中分離富集CHP,成功建立了玉米CHP的分離、純化體系,最終得到的組分A2-b中玉米CHP含量為97.36%,純化倍數(shù)為45.1倍。將純化后的終產(chǎn)物進行UPLC-MS/MS測定,鑒定出組分A2-b中目標肽的氨基酸序列結構為cyclo(His-Pro),分子量為235.7Da。NMR和傅里葉紅外光譜的結構鑒定結果顯示,組分A2-b為目標化合物。體外降血糖和抗氧化試驗結果表明,采用本研究建立的分離純化方法得到的玉米CHP表現(xiàn)出最高的α-葡萄糖苷酶抑制活性、DPPH自由基清除活性和還原力。反應動力學和分子對接模擬結果表明,玉米CHP能夠競爭性地抑制α-葡萄糖苷酶活性,IC50值為1.3mg/mL,抑制常數(shù)為1.02mg/mL。CHP可進入α-葡萄糖苷酶的底物結合部位,通過范德華力、氫鍵等分子間作用力與酶活性中心及周圍氨基酸殘基產(chǎn)生相互作用,發(fā)揮抑制作用,為后續(xù)體內(nèi)降血糖研究和進一步開發(fā)提供一定的基礎和依據(jù)。6、以四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠為模型,將純化后的玉米CHP按一定劑量進行長期灌胃給藥,實驗結果表明,玉米CHP能在一定程度上緩解糖尿病小鼠的多飲、多食、多尿及消瘦癥狀,降低糖尿病小鼠的空腹血糖水平,改善口服糖耐量,促進胰島素的分泌。此外,玉米CHP可降低糖尿病小鼠的血脂水平,能在一定程度上改善糖尿病小鼠的脂代謝紊亂。此外,實驗中還發(fā)現(xiàn)玉米CHP能夠降低糖尿病小鼠血清中一氧化氮(nitric oxide,NO)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,表明玉米CHP能夠清除四氧嘧啶產(chǎn)生的NO和氧自由基,降低脂質過氧化,緩解氧化應激對機體的損害。組織病理學分析結果表明,玉米CHP對四氧嘧啶誘發(fā)的糖尿病小鼠所致胰腺和肝臟損害具有一定的改善作用。實驗結果表明,玉米CHP的小鼠體內(nèi)降血糖機制為通過清除四氧嘧啶產(chǎn)生的NO和氧自由基,提高機體抗氧化功能,抑制氧化應激作用對胰島β細胞、肝臟等組織的損傷,對胰島β細胞和肝細胞損害具有一定的保護和修復作用,從而促進胰島素的分泌,緩解糖尿病并發(fā)癥。
[Abstract]:The histidine - proline cyclodipeptide ( CHP ) is a cyclic dipeptide formed by connecting proline and histidine through a pair of complementary peptide bonds . The pharmacological study finds that CHP has the physiological functions of relieving alcohol anesthesia , protecting neurons , lowering blood sugar , resisting oxidation and the like . The results of this study are as follows : 1 . The results of this study are as follows : 1 . It has the advantages of short reaction route , cheap and easily available raw materials , simple post - treatment , short production period , green environmental protection and so on . The results show that the main subunit bands of the three proteins are alcohol - soluble protein , protein - 1 ( G1 - glutelin ) and gluten - 2 ( G2 - glutelin ) . The results show that the protein components of the three proteins are mainly alcohol - soluble protein , protein - 1 ( G1 - glutelin ) and glutathione - 2 ( G2 - glutelin ) . The optimum conditions for the preparation of chp precursor dipeptide from corn protein hydrolysate by orthogonal experiments were as follows : reaction pressure 0.2 MPa , reaction temperature 120 鈩，

本文編號：2020823