本文選題：UDCA + 肝細(xì)胞肝癌�。� 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景及目的肝癌患者占據(jù)全世界所有腫瘤發(fā)生的6%和全世界由于腫瘤死亡人數(shù)的9%。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計,2012年,由于肝癌死亡人數(shù)估計為746000。肝癌是世界范圍內(nèi)由于腫瘤原因死亡的排名第二的最常見腫瘤,而其中超過一半的肝癌患者在中國。中國作為肝癌高發(fā)國家,對肝癌的診療迫在眉睫。隨著科學(xué)的進步和發(fā)展,肝癌的治療手段也變得多種多樣,從單純手術(shù)切除,到經(jīng)肝動脈栓塞化療(Transarterial chemoembolization,TACE),從傳統(tǒng)化療到生物靶向治療,從無法手術(shù)治療到可以進行肝移植,醫(yī)生及科學(xué)研究者積極研究,并積極嘗試和采取各種治療手段以期提高患者的生存率和生存質(zhì)量。雖然靶向治療是當(dāng)今腫瘤治療的一個新的熱點,但是,傳統(tǒng)的化療對肝癌的治療仍然有著其不可或缺的重要作用。中國傳統(tǒng)的中醫(yī)中藥具有悠久的歷史。2015年中國科學(xué)家屠呦呦因為發(fā)現(xiàn)青蒿素獲得了諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。雖然青蒿素與傳統(tǒng)意義的中藥關(guān)系不大,但是卻也為我們發(fā)現(xiàn)新藥提供了新的思路。熊去氧膽酸(Ursodeoxycholic acid,UDCA)源于熊膽中,是一利次級膽汁酸。UDCA是美國FDA唯一批準(zhǔn)用于原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis,PBC)的藥物。而近年來,UDCA的抑癌作用受到廣泛關(guān)注。老藥新用一直是科學(xué)研究中永不消退的熱點之一。研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)UDCA可以抑制腫瘤生長。Brasitus TA和Bernstein CN等通過動物實驗及人體的標(biāo)本研究證實UDCA對于結(jié)直腸癌具有抑制作用。Lim SC等發(fā)現(xiàn)UDCA可以通過介導(dǎo)死亡受體5(Death receptor 5,DR5)和MEK/ERK途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。同時證明UDCA可以抑制胃癌移植瘤小鼠的生長。劉慧博士研究發(fā)現(xiàn),鵝脫氧膽酸衍生物HS-1200可以通過促進凋亡而達到抑制肝細(xì)胞肝癌的作用。屈文東博士研究發(fā)現(xiàn),UDCA可以通過COPS5作用于肝癌細(xì)胞抑制肝細(xì)胞肝癌。UDCA抑制肝細(xì)胞肝癌的作用機制開始受到關(guān)注。2016年,日本科學(xué)家大隅良典因為在細(xì)胞自噬機制方面的研究發(fā)現(xiàn)被授予了 2016年的諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎。自噬已經(jīng)作為一個新興熱點嶄露頭角。自噬是細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外物質(zhì)被運送到溶酶體而降解的這一機制的廣泛定義。越來越多的研究證實自噬在抑制癌癥發(fā)生中發(fā)揮重要作用。在低氧和缺氧的環(huán)境下可以誘發(fā)自噬,自噬在控制程序性細(xì)胞死亡具有重要作用,并且可以介導(dǎo)腫瘤相關(guān)反應(yīng)。Lim SC等證明UDCA可以通過減少ATG5的表達水平誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬的發(fā)生。而UDCA是否通過自噬作用抑制肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生,還沒有被研究。這也是我們研究的一個切入點。另外,近年來DNA雙鏈斷裂及斷裂的雙鏈DNA重新修復(fù)一直是研究的熱點和難點。人體內(nèi)每一個細(xì)胞每天經(jīng)受接近70000次損傷,其中75%的損傷是單鏈DNA損傷(single-strand DMA,ssDMA)。一部分ssDNA損傷會轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA損傷(double-strand breaks,DSBs),盡管DSBs少見,但是更具危害性。γ-H2AX作為DNA雙鏈鍛煉的標(biāo)志物已經(jīng)得到了國際上的廣泛認(rèn)可。對于UDCA是否通過促進DSBs修復(fù)來抑制肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生也沒有相關(guān)研究,DSBs損傷修復(fù)也是我們研究UDCA對于肝細(xì)胞肝癌作用機制的一個切入點。本研究旨在從自噬和DNA損傷修復(fù)的角度,探討UDCA對肝細(xì)胞肝癌體內(nèi)以及體外的阻抑作用及作用機制,以期為后續(xù)新的肝癌治療藥物的發(fā)現(xiàn)和發(fā)明提供新的方向。第一部分熊去氧膽酸體外對人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株生長抑制作用機制研究研究目的以肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B2.1-7以及肝永生化細(xì)胞L02為研究對象,研究體外UDCA對肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的抑制作用,及細(xì)胞中γ-H2AX、LC3B和P53分子表達的變化情況。研究方法1、通過CCK-8實驗檢測UDCA對肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B2.1-7以及肝永生化細(xì)胞L02的增殖情況影響。將肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HepG2、Hepp3B2.1-7以及肝永生化細(xì)胞LO2用不同濃度USCA(0.6、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2mmol/L)分別處理 24h,48h,721h,加 CCK-8 反應(yīng)后于450nm波長處測量吸光度。2、根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果,選取肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC-7721和Hep3B2.1-7進行Transwell細(xì)胞遷移實驗以檢測UDCA作用24h后,肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞遷移能力的變化。實驗分為三組,分別為空白對照組(不加UDCA),低劑量UDCA組(加入0.8mmol/L UDCA)和高劑量UDCA組(加入1.2mmol/L UDCA)。實驗操作過程按照標(biāo)準(zhǔn)的Transwell細(xì)胞遷移實驗步驟進行。3、采用qRT-PCR和Western Blot檢測目的分子LC3B和P53 mRNA水平和蛋白水平表達變化。實驗分為三組,分別為空白對照組(不加UDCA),低劑量UDCA 組(加入 0.8mmol/LUDCA)和高劑量 UDCA 組(加入 1.2mmol/L UDCA)。實驗操作過程按照標(biāo)準(zhǔn)的qRT-PCR和Western Blot實驗操作步驟及相關(guān)試劑盒要求進行。4、采用qRT-PCR和Western Blot檢測目的分子γ-H2AX mRNA水平和蛋白水平表達變化。實驗分為三組,分別為空白對照組(不加UDCA),低劑量UDCA組(加入 0.8mmol/LUDCA)和高劑量 UDCA 組(加入 1.2mmol/LUDCA)。實驗操作過程按照標(biāo)準(zhǔn)的qRT-PCR和Western Blot實驗操作步驟及相關(guān)試劑盒要求進行。研究結(jié)果1、加UDCA作用24 h后,UDCA對肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B2.1-7生長抑制作用明顯,且抑制作用具有劑量依賴性,隨著用藥量增高抑制作用有升高趨勢。實驗組與對照組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。而UDCA對肝永生化細(xì)胞L02沒有明顯的抑制作用,實驗組與對照組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2、UDC對肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HepG2和Hep3B2.1-7細(xì)胞的遷移具有抑制作用,且抑制作用具有劑量依賴性。高劑量UDCA組比低劑量UDCA組對肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系遷移的抑制作用更加明顯。實驗組與對照組,高劑量UDCA組與低劑量UDCA組的的差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3、UDCA可促進肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系SMMC-7721和HepG2細(xì)胞LC3B和p53分子mRNA水平和蛋白水平的表達增加,且促進作用具有劑量依賴性。高劑量UDCA組比低劑量UDCA組對肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系LC3B和p53分子表達的誘導(dǎo)作用更加明顯。實驗組與對照組,高劑量UDCA組與低劑量UDCA組的的差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4、使用UDCA后,肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系SMMC-7721和HepG2細(xì)胞中γ-H2AX分子mRNA水平和蛋白水平表達降低,且降低水平具有劑量依賴性。實驗組與對照組,高劑量UDCA組與低劑量UDCA組的的差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1、UDCA可抑制肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞增殖,且UDCA的抑制作用具有劑量依賴性。2、UDCA可抑制肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞遷移,且UDCA的抑制作用具有劑量依賴性。3、UDCA可促進肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞中分子LC3B和P53在mRNA水平和蛋白水平的表達,且UDCA的促進作用具有劑量依賴性。4、使用UDCA后,肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞中分子γ-H2AX在mRNA水平和蛋白水平的表達減少,且減少作用具有劑量依賴性5、UDCA可能通過促進自噬作用抑制肝細(xì)胞肝癌。6、UDCA可能通過促進DSBs損傷修復(fù)抑制肝細(xì)胞肝癌。第二部分熊去氧膽酸體內(nèi)對裸鼠肝細(xì)胞肝癌移植瘤模型抑制作用機制研究研究目的以肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系SMMC-7721裸鼠移植瘤為研究對象,研究UDCA對肝細(xì)胞肝癌裸鼠移植瘤的抑制作用及裸鼠移植瘤組織中分子γ-H2AX、LC3B和P53蛋白水平的表達情況。研究方法1、肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系SMMC-7721裸鼠移植瘤模型的制備及UDCA給藥。將在裸鼠體內(nèi)傳代后的SMMC-7721細(xì)胞用無血清的培養(yǎng)基懸浮,設(shè)置濃度為2×106個細(xì)胞每100ul。將懸浮細(xì)胞液皮下注入裸鼠肩后部平坦部位,培養(yǎng)3-4周后給藥。將裸鼠模型分為三組,分別為空白對照組(不給予UDCA),低劑量實驗組(90mg/kg/dUDCA)和高劑量實驗組(270mg/kg/dUDCA)。2、采用觀察測量、蘇木素-依紅染色、免疫組化和Western Blot方法對UDCA對肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系SMMC-7721裸鼠移植瘤抑制作用進行研究。肝細(xì)胞肝癌移植瘤裸鼠用藥7-8周后,先麻醉裸鼠,對其移植瘤大小進行體外測量,并記錄實驗結(jié)果。然后取出移植瘤,分為兩部分,一部分置于液氮中保存用于Western blot及后續(xù)實驗使用,一部分置于多聚甲醛固定用于HE染色和IHC染色。研究結(jié)果1、我們選取SMMC-7721肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系用于裸鼠移植瘤造模,用BALB/c裸鼠為移植瘤載體。造模成功后給予UDCA,觀察實驗組與對照組裸鼠的一般狀況。實驗組和對照組裸鼠的一般狀況良好,相比之下,實驗組裸鼠活潑度、食欲情況、精神狀態(tài)都優(yōu)于對照組。UDCA可明顯抑制裸鼠移植瘤大小的生長,實驗組與對照組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。且隨著UDCA劑量的增加,UDCA對移植瘤的抑制作用增強。高劑量UDCA組(270mg/kg/d)裸鼠移植瘤大小明顯小于低劑量UDCA組(90mg/kg/d)裸鼠移植瘤的大小,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2、取造模成功后,經(jīng)過/不經(jīng)過UDCA處理7-8周后的裸鼠移植瘤組織進行HE染色,染色結(jié)果顯示UDCA可以明顯促進裸鼠移植瘤的壞死,并且隨著UDCA劑量的增加,壞死范圍明顯增大。3、對裸鼠移植瘤組織進行IHC染色和Western Blot實驗。研究結(jié)果表明,UDCA可以增加裸鼠移植瘤標(biāo)本中LC3B蛋白分子的表達,實驗組與對照組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。且隨著UDCA劑量增加,UDCA對裸鼠移植瘤中LC3B蛋白分子表達的促進作用增強,這種增強作用也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4、對裸鼠移植瘤組織進行IHC染色和Western Blot實驗。研究結(jié)果表明,UDCA作用后,可使裸鼠移植瘤標(biāo)本中γ-H2AX蛋白分子的表達減少,實驗組與對照組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。并且,隨著UDCA劑量的增加,UDCA作用后的γ-H2AX分子表達的減少作用增強,這種差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1、UDCA可抑制裸鼠肝細(xì)胞肝癌移植瘤大小的生長,且抑制作用具有劑量依賴性。2、UDCA可促進裸鼠肝細(xì)胞肝癌移植瘤的壞死,且壞死程度具有劑量依賴性。3、UDCA可以促進裸鼠肝細(xì)胞肝癌移植瘤中LC3B和P53分子蛋白水平的表達,且具有劑量依賴性。4、使用UDCA后移植瘤肝細(xì)胞肝癌模型中γ-H2AX分子蛋白水平表達降低,且降低程度具有劑量依賴性。5、UDCA可能通過促進自噬作用抑制肝細(xì)胞肝癌。6、UDCA可能通過促進DSBs損傷修復(fù)抑制肝細(xì)胞肝癌。
[Abstract]:According to the World Health Organization ( WHO ) , UDCA has a long history . In recent years , it has been found that UDCA can inhibit the growth of hepatocellular carcinoma . The effects of UDCA on hepatocellular carcinoma cells ( HCC ) were investigated by CCK - 8 . The levels of LC3B and P53 mRNA and protein level were determined by qRT - PCR and Western Blot . The experiment was divided into three groups : blank control group ( without UDCA ) , low dose UDCA group ( add 0.8 mmol / LUDCA ) and high dose UDCA group ( add 1.2 mmol / L UDCA ) . The expression of 緯 - H2AX mRNA and protein level were determined by qRT - PCR and Western Blot . The results were divided into three groups : blank control group ( without UDCA ) , low dose UDCA group ( add 0.8 mmol / LUDCA ) and high dose UDCA group ( add 1.2 mmol / LUDCA ) . The results showed that UDCA inhibited the proliferation of hepatocellular carcinoma cell line ( HCC ) , and the inhibitory effect of UDCA on hepatocellular carcinoma cell line ( HCC ) was significantly higher than that in control group ( P0.05 ) . The results showed that UDCA could increase the expression of LC3B protein in nude mice . The results showed that UDCA could increase the expression of LC3B protein in nude mice .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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2 王亮;肖沖;沈邵偉;王學(xué)民;徐艷峰;劉江寧;秦川;;一月齡土撥鼠肝炎病毒感染模型的建立[J];中國病毒病雜志;2014年03期

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1 劉慧;鵝脫氧膽酸衍生物HS-1200阻抑肝癌的實驗研究[D];山東大學(xué);2008年

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本文編號：1995570