本文選題：UDCA + 肝細(xì)胞肝癌��； 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景及目的肝癌患者占據(jù)全世界所有腫瘤發(fā)生的6%和全世界由于腫瘤死亡人數(shù)的9%。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì),2012年,由于肝癌死亡人數(shù)估計(jì)為746000。肝癌是世界范圍內(nèi)由于腫瘤原因死亡的排名第二的最常見腫瘤,而其中超過一半的肝癌患者在中國。中國作為肝癌高發(fā)國家,對(duì)肝癌的診療迫在眉睫。隨著科學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展,肝癌的治療手段也變得多種多樣,從單純手術(shù)切除,到經(jīng)肝動(dòng)脈栓塞化療(Transarterial chemoembolization,TACE),從傳統(tǒng)化療到生物靶向治療,從無法手術(shù)治療到可以進(jìn)行肝移植,醫(yī)生及科學(xué)研究者積極研究,并積極嘗試和采取各種治療手段以期提高患者的生存率和生存質(zhì)量。雖然靶向治療是當(dāng)今腫瘤治療的一個(gè)新的熱點(diǎn),但是,傳統(tǒng)的化療對(duì)肝癌的治療仍然有著其不可或缺的重要作用。中國傳統(tǒng)的中醫(yī)中藥具有悠久的歷史。2015年中國科學(xué)家屠呦呦因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)青蒿素獲得了諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。雖然青蒿素與傳統(tǒng)意義的中藥關(guān)系不大,但是卻也為我們發(fā)現(xiàn)新藥提供了新的思路。熊去氧膽酸(Ursodeoxycholic acid,UDCA)源于熊膽中,是一利次級(jí)膽汁酸。UDCA是美國FDA唯一批準(zhǔn)用于原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis,PBC)的藥物。而近年來,UDCA的抑癌作用受到廣泛關(guān)注。老藥新用一直是科學(xué)研究中永不消退的熱點(diǎn)之一。研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)UDCA可以抑制腫瘤生長(zhǎng)。Brasitus TA和Bernstein CN等通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及人體的標(biāo)本研究證實(shí)UDCA對(duì)于結(jié)直腸癌具有抑制作用。Lim SC等發(fā)現(xiàn)UDCA可以通過介導(dǎo)死亡受體5(Death receptor 5,DR5)和MEK/ERK途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。同時(shí)證明UDCA可以抑制胃癌移植瘤小鼠的生長(zhǎng)。劉慧博士研究發(fā)現(xiàn),鵝脫氧膽酸衍生物HS-1200可以通過促進(jìn)凋亡而達(dá)到抑制肝細(xì)胞肝癌的作用。屈文東博士研究發(fā)現(xiàn),UDCA可以通過COPS5作用于肝癌細(xì)胞抑制肝細(xì)胞肝癌。UDCA抑制肝細(xì)胞肝癌的作用機(jī)制開始受到關(guān)注。2016年,日本科學(xué)家大隅良典因?yàn)樵诩?xì)胞自噬機(jī)制方面的研究發(fā)現(xiàn)被授予了 2016年的諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。自噬已經(jīng)作為一個(gè)新興熱點(diǎn)嶄露頭角。自噬是細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外物質(zhì)被運(yùn)送到溶酶體而降解的這一機(jī)制的廣泛定義。越來越多的研究證實(shí)自噬在抑制癌癥發(fā)生中發(fā)揮重要作用。在低氧和缺氧的環(huán)境下可以誘發(fā)自噬,自噬在控制程序性細(xì)胞死亡具有重要作用,并且可以介導(dǎo)腫瘤相關(guān)反應(yīng)。Lim SC等證明UDCA可以通過減少ATG5的表達(dá)水平誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬的發(fā)生。而UDCA是否通過自噬作用抑制肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生,還沒有被研究。這也是我們研究的一個(gè)切入點(diǎn)。另外,近年來DNA雙鏈斷裂及斷裂的雙鏈DNA重新修復(fù)一直是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。人體內(nèi)每一個(gè)細(xì)胞每天經(jīng)受接近70000次損傷,其中75%的損傷是單鏈DNA損傷(single-strand DMA,ssDMA)。一部分ssDNA損傷會(huì)轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA損傷(double-strand breaks,DSBs),盡管DSBs少見,但是更具危害性。γ-H2AX作為DNA雙鏈鍛煉的標(biāo)志物已經(jīng)得到了國際上的廣泛認(rèn)可。對(duì)于UDCA是否通過促進(jìn)DSBs修復(fù)來抑制肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生也沒有相關(guān)研究,DSBs損傷修復(fù)也是我們研究UDCA對(duì)于肝細(xì)胞肝癌作用機(jī)制的一個(gè)切入點(diǎn)。本研究旨在從自噬和DNA損傷修復(fù)的角度,探討UDCA對(duì)肝細(xì)胞肝癌體內(nèi)以及體外的阻抑作用及作用機(jī)制,以期為后續(xù)新的肝癌治療藥物的發(fā)現(xiàn)和發(fā)明提供新的方向。第一部分熊去氧膽酸體外對(duì)人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株生長(zhǎng)抑制作用機(jī)制研究研究目的以肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B2.1-7以及肝永生化細(xì)胞L02為研究對(duì)象,研究體外UDCA對(duì)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的抑制作用,及細(xì)胞中γ-H2AX、LC3B和P53分子表達(dá)的變化情況。研究方法1、通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UDCA對(duì)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B2.1-7以及肝永生化細(xì)胞L02的增殖情況影響。將肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HepG2、Hepp3B2.1-7以及肝永生化細(xì)胞LO2用不同濃度USCA(0.6、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2mmol/L)分別處理 24h,48h,721h,加 CCK-8 反應(yīng)后于450nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。2、根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC-7721和Hep3B2.1-7進(jìn)行Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)UDCA作用24h后,肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞遷移能力的變化。實(shí)驗(yàn)分為三組,分別為空白對(duì)照組(不加UDCA),低劑量UDCA組(加入0.8mmol/L UDCA)和高劑量UDCA組(加入1.2mmol/L UDCA)。實(shí)驗(yàn)操作過程按照標(biāo)準(zhǔn)的Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。3、采用qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)目的分子LC3B和P53 mRNA水平和蛋白水平表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)分為三組,分別為空白對(duì)照組(不加UDCA),低劑量UDCA 組(加入 0.8mmol/LUDCA)和高劑量 UDCA 組(加入 1.2mmol/L UDCA)。實(shí)驗(yàn)操作過程按照標(biāo)準(zhǔn)的qRT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)操作步驟及相關(guān)試劑盒要求進(jìn)行。4、采用qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)目的分子γ-H2AX mRNA水平和蛋白水平表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)分為三組,分別為空白對(duì)照組(不加UDCA),低劑量UDCA組(加入 0.8mmol/LUDCA)和高劑量 UDCA 組(加入 1.2mmol/LUDCA)。實(shí)驗(yàn)操作過程按照標(biāo)準(zhǔn)的qRT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)操作步驟及相關(guān)試劑盒要求進(jìn)行。研究結(jié)果1、加UDCA作用24 h后,UDCA對(duì)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B2.1-7生長(zhǎng)抑制作用明顯,且抑制作用具有劑量依賴性,隨著用藥量增高抑制作用有升高趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而UDCA對(duì)肝永生化細(xì)胞L02沒有明顯的抑制作用,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2、UDC對(duì)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HepG2和Hep3B2.1-7細(xì)胞的遷移具有抑制作用,且抑制作用具有劑量依賴性。高劑量UDCA組比低劑量UDCA組對(duì)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系遷移的抑制作用更加明顯。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組,高劑量UDCA組與低劑量UDCA組的的差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3、UDCA可促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系SMMC-7721和HepG2細(xì)胞LC3B和p53分子mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)增加,且促進(jìn)作用具有劑量依賴性。高劑量UDCA組比低劑量UDCA組對(duì)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系LC3B和p53分子表達(dá)的誘導(dǎo)作用更加明顯。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組,高劑量UDCA組與低劑量UDCA組的的差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4、使用UDCA后,肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系SMMC-7721和HepG2細(xì)胞中γ-H2AX分子mRNA水平和蛋白水平表達(dá)降低,且降低水平具有劑量依賴性。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組,高劑量UDCA組與低劑量UDCA組的的差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1、UDCA可抑制肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞增殖,且UDCA的抑制作用具有劑量依賴性。2、UDCA可抑制肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞遷移,且UDCA的抑制作用具有劑量依賴性。3、UDCA可促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞中分子LC3B和P53在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá),且UDCA的促進(jìn)作用具有劑量依賴性。4、使用UDCA后,肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞中分子γ-H2AX在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)減少,且減少作用具有劑量依賴性5、UDCA可能通過促進(jìn)自噬作用抑制肝細(xì)胞肝癌。6、UDCA可能通過促進(jìn)DSBs損傷修復(fù)抑制肝細(xì)胞肝癌。第二部分熊去氧膽酸體內(nèi)對(duì)裸鼠肝細(xì)胞肝癌移植瘤模型抑制作用機(jī)制研究研究目的以肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系SMMC-7721裸鼠移植瘤為研究對(duì)象,研究UDCA對(duì)肝細(xì)胞肝癌裸鼠移植瘤的抑制作用及裸鼠移植瘤組織中分子γ-H2AX、LC3B和P53蛋白水平的表達(dá)情況。研究方法1、肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系SMMC-7721裸鼠移植瘤模型的制備及UDCA給藥。將在裸鼠體內(nèi)傳代后的SMMC-7721細(xì)胞用無血清的培養(yǎng)基懸浮,設(shè)置濃度為2×106個(gè)細(xì)胞每100ul。將懸浮細(xì)胞液皮下注入裸鼠肩后部平坦部位,培養(yǎng)3-4周后給藥。將裸鼠模型分為三組,分別為空白對(duì)照組(不給予UDCA),低劑量實(shí)驗(yàn)組(90mg/kg/dUDCA)和高劑量實(shí)驗(yàn)組(270mg/kg/dUDCA)。2、采用觀察測(cè)量、蘇木素-依紅染色、免疫組化和Western Blot方法對(duì)UDCA對(duì)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系SMMC-7721裸鼠移植瘤抑制作用進(jìn)行研究。肝細(xì)胞肝癌移植瘤裸鼠用藥7-8周后,先麻醉裸鼠,對(duì)其移植瘤大小進(jìn)行體外測(cè)量,并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。然后取出移植瘤,分為兩部分,一部分置于液氮中保存用于Western blot及后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用,一部分置于多聚甲醛固定用于HE染色和IHC染色。研究結(jié)果1、我們選取SMMC-7721肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系用于裸鼠移植瘤造模,用BALB/c裸鼠為移植瘤載體。造模成功后給予UDCA,觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組裸鼠的一般狀況。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組裸鼠的一般狀況良好,相比之下,實(shí)驗(yàn)組裸鼠活潑度、食欲情況、精神狀態(tài)都優(yōu)于對(duì)照組。UDCA可明顯抑制裸鼠移植瘤大小的生長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。且隨著UDCA劑量的增加,UDCA對(duì)移植瘤的抑制作用增強(qiáng)。高劑量UDCA組(270mg/kg/d)裸鼠移植瘤大小明顯小于低劑量UDCA組(90mg/kg/d)裸鼠移植瘤的大小,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2、取造模成功后,經(jīng)過/不經(jīng)過UDCA處理7-8周后的裸鼠移植瘤組織進(jìn)行HE染色,染色結(jié)果顯示UDCA可以明顯促進(jìn)裸鼠移植瘤的壞死,并且隨著UDCA劑量的增加,壞死范圍明顯增大。3、對(duì)裸鼠移植瘤組織進(jìn)行IHC染色和Western Blot實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果表明,UDCA可以增加裸鼠移植瘤標(biāo)本中LC3B蛋白分子的表達(dá),實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。且隨著UDCA劑量增加,UDCA對(duì)裸鼠移植瘤中LC3B蛋白分子表達(dá)的促進(jìn)作用增強(qiáng),這種增強(qiáng)作用也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4、對(duì)裸鼠移植瘤組織進(jìn)行IHC染色和Western Blot實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果表明,UDCA作用后,可使裸鼠移植瘤標(biāo)本中γ-H2AX蛋白分子的表達(dá)減少,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。并且,隨著UDCA劑量的增加,UDCA作用后的γ-H2AX分子表達(dá)的減少作用增強(qiáng),這種差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1、UDCA可抑制裸鼠肝細(xì)胞肝癌移植瘤大小的生長(zhǎng),且抑制作用具有劑量依賴性。2、UDCA可促進(jìn)裸鼠肝細(xì)胞肝癌移植瘤的壞死,且壞死程度具有劑量依賴性。3、UDCA可以促進(jìn)裸鼠肝細(xì)胞肝癌移植瘤中LC3B和P53分子蛋白水平的表達(dá),且具有劑量依賴性。4、使用UDCA后移植瘤肝細(xì)胞肝癌模型中γ-H2AX分子蛋白水平表達(dá)降低,且降低程度具有劑量依賴性。5、UDCA可能通過促進(jìn)自噬作用抑制肝細(xì)胞肝癌。6、UDCA可能通過促進(jìn)DSBs損傷修復(fù)抑制肝細(xì)胞肝癌。
[Abstract]:According to the World Health Organization ( WHO ) , UDCA has a long history . In recent years , it has been found that UDCA can inhibit the growth of hepatocellular carcinoma . The effects of UDCA on hepatocellular carcinoma cells ( HCC ) were investigated by CCK - 8 . The levels of LC3B and P53 mRNA and protein level were determined by qRT - PCR and Western Blot . The experiment was divided into three groups : blank control group ( without UDCA ) , low dose UDCA group ( add 0.8 mmol / LUDCA ) and high dose UDCA group ( add 1.2 mmol / L UDCA ) . The expression of 緯 - H2AX mRNA and protein level were determined by qRT - PCR and Western Blot . The results were divided into three groups : blank control group ( without UDCA ) , low dose UDCA group ( add 0.8 mmol / LUDCA ) and high dose UDCA group ( add 1.2 mmol / LUDCA ) . The results showed that UDCA inhibited the proliferation of hepatocellular carcinoma cell line ( HCC ) , and the inhibitory effect of UDCA on hepatocellular carcinoma cell line ( HCC ) was significantly higher than that in control group ( P0.05 ) . The results showed that UDCA could increase the expression of LC3B protein in nude mice . The results showed that UDCA could increase the expression of LC3B protein in nude mice .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1995570