本文選題：動(dòng)脈粥樣硬化 + 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體��； 參考：《山東大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：背景 TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand,腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體),是腫瘤壞死因子超家族的成員之一,由Wiley等于1995年首次從表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tag, EST)數(shù)據(jù)庫(kù)中分離和鑒定出來(lái)。TRAIL與Fas配體(FasL,Apo1L或CD95)和腫瘤壞死因子-α (TNF-α)分別具有28%和23%的同源性。1996年研究者分離出由281個(gè)氨基酸組成、分子量為32.5kD的蛋白質(zhì),因其與FasL具有較高的同源性,該研究將其命名為凋亡素配體2(apoptosis2-ligand, Apo2L)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)Apo2L和TRAIL是同一種因子。 目前發(fā)現(xiàn)的TRAIL受體有5種：TRAIL-R1/DR4(death receptor4)、 TRAIL-R2/DR5(death receptor5)、TRAIL-R3/DcRl (decoy receptor1)、 TRAIL-R4/DcR2(decoy receptor1)和骨保護(hù)素(osteoprotegerin, OPG)。按其功能和結(jié)構(gòu)可分為三類：(1)死亡受體：DR4和DR5；(2)誘騙受體：DcRl和DcR2(3)可溶性受體骨保護(hù)素。DR4和DR5分別由468和411個(gè)氨基酸殘基組成,二者有55%的同源性。TRAIL與這兩種受體結(jié)合后誘導(dǎo)敏感細(xì)胞的凋亡。小鼠體內(nèi)僅有DR5的表達(dá)。 TRAIL除了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用外,研究還發(fā)現(xiàn)TRAIL有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、分化,調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答功能和免疫耐受機(jī)制的作用,以及參與調(diào)節(jié)干細(xì)胞的生理功能。TRAIL主要由免疫細(xì)胞生產(chǎn)(如自然殺傷T細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞),而TRAIL的受體在體內(nèi)是廣泛表達(dá)的。在血管中,TRAIL受體在平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)。因此,越來(lái)越多的證據(jù)顯示TRAIL在調(diào)節(jié)正常血管生物學(xué)功能以及在血管疾病的發(fā)生中都可能具有重要作用。TRAIL功能缺失實(shí)驗(yàn)證實(shí)如果敲除TRAIL基因則導(dǎo)致ApoE-/-小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊增大,提示內(nèi)源性的TRAIL可能對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生具有保護(hù)作用。最近,Michowitz等進(jìn)行的一項(xiàng)臨床病例觀察研究中,結(jié)果顯示急性冠脈綜合癥病人血漿中可溶性TRAIL表達(dá)水平明顯低于穩(wěn)定性心絞痛和正常對(duì)照組,與C反應(yīng)蛋白呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。該研究提示TRAIL對(duì)ACS患者斑塊的穩(wěn)定性可能起著一定的保護(hù)作用。根據(jù)這些研究結(jié)果人們提出TRAIL有可能作為一種新的治療手段用于治療與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的心血管疾病。 然而,TRAIL對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的藥理作用的量效關(guān)系尚沒(méi)有被系統(tǒng)地詮釋,目前一個(gè)尚未澄清的重要科學(xué)問(wèn)題是過(guò)量產(chǎn)生的或外源性給予的TRAIL是否具真的具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用?值得注意的是,有不少證據(jù)顯示過(guò)高的TRAIL水平可能具有促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的作用。 例如,有研究報(bào)道,外源性TRAIL刺激可以增加血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng),上調(diào)E-選擇素(E-selectin),細(xì)胞間粘附分子1(intercellular adhesion molecule,(ICAM)-1)和白介素-8(interleukin (IL)-8)的表達(dá)。并且,在機(jī)體處于炎癥狀態(tài)下血漿TRAIL的水平呈升高趨勢(shì),而慢性炎癥狀態(tài)是誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素。雖然有一項(xiàng)研究報(bào)道在動(dòng)脈粥樣硬化合并糖尿病的小鼠中TRAIL可能通過(guò)引起巨噬細(xì)胞的凋亡而減輕斑塊負(fù)荷,但這只是在晚期斑塊且合并糖尿病的情況下觀察到的,而且晚期斑塊中巨噬細(xì)胞凋亡的增加還可能導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定。因此,目前的研究證據(jù)還不足以證明給予外源性的TRAIL干預(yù)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化,特別是早期的斑塊形成,是具有抑制作用還是促進(jìn)作用。 目的 1.研究外源性TRAIL干預(yù)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的作用。 2.用雙敲基因小鼠模型進(jìn)一步證實(shí)DR5受體在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的作用。 3.研究TRAIL對(duì)早期斑塊和晚期斑塊不同影響背后的機(jī)制。 方法 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：8周齡雄性apoE-/-小鼠購(gòu)自北京維通利華公司,8周齡雄性LDLR-/-小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所,DR5-/-小鼠購(gòu)自美國(guó)Mutant Mouse Regional Resource Centers (MMRRC)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求和規(guī)定。 2. TRAIL對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的作用：將8周齡雄性apoE-/-小鼠分成正常對(duì)照組和TRAIL過(guò)表達(dá)組,TRAIL過(guò)表達(dá)組給予重組TRAIL腹腔注射(3μg每只,每周一次),持續(xù)4周或8周。對(duì)照組注射等量生理鹽水。為了排除高脂飲食對(duì)TRAIL的影響,本研究設(shè)置普通或高脂飲食組。 3. TRAIL對(duì)LDLR-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的作用：將8周齡雄性apoE-/-小鼠或LDLR-/-小鼠給予高脂飲食8周,然后在繼續(xù)高脂飲食的基礎(chǔ)上,分成正常對(duì)照組和TRAIL過(guò)表達(dá)組,TRAIL過(guò)表達(dá)組給予重組TRAIL腹腔注射(3μg每只,每周一次)8周。對(duì)照組注射等量生理鹽水。4.DR5-/-apoE-/-小鼠模型構(gòu)建：8周齡apoe-/-和DR5-/-小鼠按照一雄兩雌進(jìn)行交配繁殖,雜一代基因型均為DR5-/-apoE+/-，雜一代在8周齡時(shí)繼續(xù)進(jìn)行交配繁殖,后代經(jīng)鼠尾組織DNA提取,PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物電泳分析后分出DR5-/-apoE-/-和DR5+/+apoE-/-小鼠。 5.組織樣本采集：各組小鼠均禁食過(guò)夜,應(yīng)用0.8%戊巴比妥鈉麻醉后從心尖抽取血液。小鼠安樂(lè)死后,分別收集心臟、血管、肝臟等組織。用于分子生物學(xué)研究如檢測(cè)mRNA、蛋白表達(dá)等的的組織樣本,待分離后置于組織凍存管,迅速放在液氮中防止其裂解,后保存于-80℃?zhèn)溆�。用于制備冰凍或石蠟切片并常�?guī)染色、組化等研究的組織則置于4%多聚甲醛中4℃固定過(guò)夜,后置于1×PBS溶液中。 6.血脂水平檢測(cè)：從小鼠心尖抽取血液并分離血漿,并檢測(cè)血漿中總膽固醇(TC)、總甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)和血糖水平。 7.組織學(xué)染色以及免疫組織化學(xué)染色：主動(dòng)脈根部組織切片進(jìn)行HE染色觀察形態(tài),進(jìn)行油紅0染色反映斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量,進(jìn)行Masson染色來(lái)評(píng)估膠原含量。各指標(biāo)的蛋白表達(dá)情況應(yīng)用相應(yīng)的免疫組織化學(xué)染色檢測(cè),TUNEL染色檢測(cè)斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡。 8.外周血單核細(xì)胞表型檢測(cè)：8周齡雄性apoE-/-小鼠,外源性TRAIL過(guò)表達(dá)干預(yù)2周(對(duì)照組注射等量生理鹽水)。取外周血,免疫磁珠分選出CD115+單核細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CDllb、Ly6C/Gr1、CCR2、CCR5、CX3CR1的表達(dá)。 9.細(xì)胞凋亡檢測(cè)：主動(dòng)脈根部切片及細(xì)胞爬片應(yīng)用TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡；懸浮細(xì)胞應(yīng)用Annexin V-FITC流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組之間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；多組之間比較采用one-way ANO VA檢驗(yàn)及q檢驗(yàn)。設(shè)P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.外源性TRAIL干預(yù)促進(jìn)高脂血癥小鼠斑塊的生長(zhǎng) 大體油紅O染色提示早期TRAIL過(guò)表達(dá)組小鼠的自主動(dòng)脈弓、胸主動(dòng)脈、腹主動(dòng)脈至髂總動(dòng)脈斑塊面積明顯高于生理鹽水對(duì)照組,并且TTRAIL促進(jìn)斑塊生長(zhǎng)的作用不受小鼠飲食的影響。橫截面切片分析也證實(shí),TRAIL過(guò)表達(dá)組小鼠主動(dòng)脈根部的斑塊明顯高于生理鹽水對(duì)照組。 2.外源性TRAIL干預(yù)不改變apoE-/-小鼠外周血單核細(xì)胞表型 為了闡明TRAIL是否在外周血單核細(xì)胞遷移至血管壁之前就影響其表型,本研究在外源性TRAIL干預(yù)2周后,取apoE-/-小鼠外周血CD115+單核細(xì)胞,并證實(shí)90%的細(xì)胞為CDllb+。與對(duì)照組相比,外源性TRAIL干預(yù)并不影響CDllb+單核細(xì)胞表面Ly6C/Gr1、CCR2、CCR5、CX3CR1的表達(dá),提示TRAIL干預(yù)引起ApoE-/-小鼠斑塊的生長(zhǎng)并不依賴于改變外周血單核細(xì)胞的表型。 3.外源性TRAIL干預(yù)引起血管炎癥反應(yīng) 為了研究TRAIL是否引起apoE-/-小鼠血管炎癥反應(yīng),分離出apoE-/-小鼠的主動(dòng)脈(升主動(dòng)脈至髂總動(dòng)脈)組織進(jìn)行PCR,檢測(cè)炎癥指標(biāo)的表達(dá)。結(jié)果顯示,TRAIL干預(yù)組血管組織中炎癥因子MCP-1, RANTES, VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)較對(duì)照組顯著升高,而對(duì)CX3CL1的表達(dá)沒(méi)有影響,并且這種作用不受飲食的影響。另外,TNF-α、E-選擇素和IL-1也有明顯升高。這些證據(jù)證實(shí),外源性TRAIL干預(yù)引起了apoE-/-小鼠血管炎癥反應(yīng)。應(yīng)用MCP-1和RANTES的中和抗體合并TRAIL對(duì)apoE-/-小鼠進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示,TRAIL導(dǎo)致的斑塊增大作用能夠被MCP-1/RANTES中和抗體阻斷 4.TRAIL促進(jìn)斑塊的生長(zhǎng)依賴于受體DR5 為了驗(yàn)證TRAIL的促斑塊生長(zhǎng)作用是否依賴于其受體DR5,我們將DR5-/-apoE-/-和DR5+/+apoE-/-小鼠分別高脂喂養(yǎng)8周后比較。大體油紅O染色顯示DR5-/-aooE-/-小鼠的主動(dòng)脈弓,胸主動(dòng)脈,腹主動(dòng)脈和髂總動(dòng)脈處斑塊較DR5+/+apoE-/-小鼠明顯減少。橫截面切片分析也證實(shí),DR5-/-apoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部的斑塊明顯低于DR5+/+apoE-/-小鼠。而外源性給予DR5-/-apoE-/-小鼠TRAIL干預(yù)后,斑塊面積也沒(méi)有顯著變化。 5.TRAIL引起斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞凋亡并和細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)相關(guān) 以往研究發(fā)現(xiàn)TRAIL可減小糖尿病小鼠晚期斑塊的面積,提示TRAIL可能對(duì)早期和晚期斑塊有不同的作用。我們通過(guò)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)早期斑塊和晚期斑塊中巨噬細(xì)胞的一個(gè)不同點(diǎn)是晚期斑塊的巨噬細(xì)胞可能存在明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(ER stress)�；谝陨蠁�(wèn)題,我們提出假設(shè)：晚期斑塊中巨噬細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)能通過(guò)上調(diào)DR5受體的表達(dá)增加巨噬細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡作用的敏感性。 通過(guò)TUNEL染色,我們觀察到,在apoE-/-小鼠斑塊形成早期(8周),TRAIL并沒(méi)有引起斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡的顯著增加,而到了斑塊形成晚期(16周),較對(duì)照組而言,外源性TRAIL引起明顯的斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡的增加。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),TRAIL主要引起巨噬細(xì)胞的凋亡。 我們檢測(cè)了早期斑塊(8周)和晚期斑塊(16周)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的水平,發(fā)現(xiàn)在晚期斑塊中CHOP和GPR78的表達(dá)水平明顯升高。在體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)和人單核巨噬細(xì)胞(THP-1)中觀察用衣霉素(tunicamycin,Tm)處理誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后,DR5、CHOP和GPR78表達(dá)升高,TRAIL引起的凋亡反應(yīng)增強(qiáng)。 為明確ER stress上調(diào)DR5表達(dá)的分子生物學(xué)機(jī)制,根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道,CHOP蛋白可能與DR5的啟動(dòng)子(promoter)結(jié)合,直接調(diào)控DR5的轉(zhuǎn)錄水平。我們用siRNA抑制CHOP的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Tm誘導(dǎo)DR5表達(dá)增加的作用被抑制了(圖41)；同樣我們應(yīng)用siRNA抑制CHOP.DR5的表達(dá),TRAIL引起的細(xì)胞凋亡也相應(yīng)減少。最后我們利用染色質(zhì)免疫沉淀(CHIP)的方法檢測(cè)到CHOP和DR5的啟動(dòng)子區(qū)域直接結(jié)合,tunicamycin處理后CHOP的結(jié)合增多。結(jié)論 (1)外源性TRAIL干預(yù)可顯著加重高脂血癥小鼠AS的病變,并且不受飲食方式的改變的影響。 (2) TRAIL是通過(guò)引起apoE-/-小鼠血管組織固有細(xì)胞的炎癥反應(yīng)而不是改變血液中單核細(xì)胞的表型起到促AS形成的作用。 (3)動(dòng)脈粥樣硬化晚期斑塊中巨噬細(xì)胞存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)上調(diào)DR5受體的表達(dá)增加巨噬細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡作用的敏感性。這種機(jī)制可能解釋為什么TRAIL對(duì)晚期斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的致凋亡作用與早期斑塊的不同。 背景 動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是由多種病因?qū)е碌氖及l(fā)于動(dòng)脈壁內(nèi)膜的一系列復(fù)雜細(xì)胞和分子改變的總結(jié)果。 目前比較公認(rèn)的是AS發(fā)生的慢性炎癥假說(shuō)。研究指出AS病變是一種具備慢性炎癥反應(yīng)特征的病理過(guò)程：AS的發(fā)展過(guò)程在正常情況下實(shí)際上是一種血管壁內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞損傷的保護(hù)反應(yīng)。在這個(gè)過(guò)程炎癥反應(yīng)是始終伴隨著的,而當(dāng)反應(yīng)過(guò)度時(shí)就演變?yōu)榧膊顟B(tài)進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,AS病變的形成主要與三個(gè)過(guò)程有關(guān)：(1)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,平滑肌細(xì)胞的增生、淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),釋放炎癥及趨化因子；(2)由平滑肌細(xì)胞分泌膠原纖維、彈性纖維蛋白等結(jié)締組織基質(zhì)的形成；(3)脂質(zhì)(包括游離的以及被修飾的脂蛋白)在基質(zhì)和泡沫細(xì)胞中的聚積。 慢性炎癥狀態(tài)是誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素。炎癥因子促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化炎癥的發(fā)生可能通過(guò)兩條途徑：改變血液中免疫細(xì)胞(主要是單核細(xì)胞)的表型和功能促進(jìn)血管炎癥發(fā)生；改變血管組織本身固有細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。在前期試驗(yàn)中我們?cè)赼poE-/-小鼠中檢測(cè)了TRAIL干預(yù)對(duì)外周血CD115+/CD11b+單核細(xì)胞表型的影響,發(fā)現(xiàn)TRAIL對(duì)外周血單核細(xì)胞表型變化的影響不顯著,而血管組織中炎癥因子的表達(dá)顯著增加。 在體外培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈和主動(dòng)脈中層平滑肌細(xì)胞中,可檢測(cè)到有TRAIL mRNA及蛋白的表達(dá),同時(shí)也可有死亡受體的表達(dá)。Sato等通過(guò)檢測(cè)人頸動(dòng)脈斑塊中的平滑肌細(xì)胞,證實(shí)DR4、DR5和Fas受體均有表達(dá),DR4的表達(dá)相對(duì)微弱,而DR5、FasL的表達(dá)非常高。免疫組織化學(xué)顯示位于斑塊纖維帽區(qū)域的VSMC表達(dá)DR5,而正常頸動(dòng)脈壁不表達(dá)。 在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,游走于內(nèi)膜下的巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)(尤其是各種被修飾的脂蛋白)從而轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞是極其重要的一環(huán),是斑塊形成的起始。研究證實(shí),巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)主要是通過(guò)其表面的清道夫受體(scavenger receptors, SRs)實(shí)現(xiàn)的。巨噬細(xì)胞表面的清道夫受體主要包括：A型清道夫受體(SR-AI和SR-AII)、B型清道夫受體(SR-BI)、CD36和LOX-1。然而,TRAIL是否影響巨噬細(xì)胞表面的清道夫受體的表達(dá)從而影響其脂質(zhì)吞噬的過(guò)程至今未有報(bào)道。 肥胖可以增加動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn),其中脂肪因子(adipokines)被認(rèn)為是脂肪調(diào)節(jié)心血管生理和病理的關(guān)鍵信使分子。脂肪組織可產(chǎn)生多種脂肪因子如TNF-α、白介素等,可由脂肪細(xì)胞或脂肪間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。TRAIL是TNF家族的成員之一,那么是否也可作為脂肪因子由脂肪組織生產(chǎn)? 基于以上研究,我們提出假說(shuō)：TRAIL可能影響血管細(xì)胞的炎癥反應(yīng)；TRAIL可能通過(guò)影響巨噬細(xì)胞表面清道夫受體的表達(dá)進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)吞噬,從而影響AS斑塊的進(jìn)程；TRAIL可能作為脂肪因子由脂肪組織產(chǎn)生并參與肥胖伴隨的動(dòng)脈粥樣硬化。 目的 1.研究TRAIL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。 2.研究TRAIL對(duì)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)吞噬的影響。 3.探討TRAIL在肥胖伴隨的動(dòng)脈粥樣硬化形成中的作用。 方法 1.細(xì)胞培養(yǎng)：HUVEC為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,以ECM(含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素、1%生長(zhǎng)因子)貼壁培養(yǎng)。RAW264.7細(xì)胞為小鼠巨噬細(xì)胞,以高糖DMEM(含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素)貼壁培養(yǎng)。THP-1細(xì)胞為人單核/巨噬細(xì)胞,以RPMI-1640(含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素)懸浮培養(yǎng)。小鼠血管平滑肌細(xì)胞以酶消化法自C57小鼠血管組織中分離,以高糖DMEM(含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素)貼壁培養(yǎng)。 2.細(xì)胞炎癥反應(yīng)檢測(cè)：HUVEC、RAW264.7及小鼠原代平滑肌細(xì)胞分別以TRAIL(10ng/ml)、TNF-a(20ng/ml)刺激6、12、24小時(shí)。收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總mRNA,應(yīng)用RT-PCR的方法檢測(cè)intercellular adhesion molecule (ICAM)-1、 vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1、monocyte chemoattractant protein (MCP)-1、E-selectin等炎癥因子的表達(dá)。 3.巨噬細(xì)胞表面清道夫受體表達(dá)測(cè)定：RAW264.7和THP-1細(xì)胞分別以TRAIL0.1、1、10和100ng/ml的濃度刺激24小時(shí),然后選擇最佳濃度刺激細(xì)胞2、4、8、16和24小時(shí)以檢測(cè)時(shí)間依賴性。收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總mRNA,應(yīng)用RT-PCR的方法檢測(cè)SR-AI、SR-B1、CD36、LOX-1清道夫受體的表達(dá)。 4.巨噬細(xì)胞脂質(zhì)吞噬功能測(cè)定：RAW264.7和THP-1細(xì)胞種于八孔腔室玻片,THP-1細(xì)胞以phorbol myristate acetate (PMA,100nM)誘導(dǎo)分化。細(xì)胞以TRAIL刺激后,將DiI標(biāo)記的乙�；兔芏戎鞍�(DiI-Ac-LDL)(30⒚g/ml)加入培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)2-8小時(shí),然后將細(xì)胞固定、染核,于激光共聚焦顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度以檢測(cè)細(xì)胞對(duì)DiI-Ac-LDL的吞噬能力；RAW264.7細(xì)胞以TRAIL刺激后,將ox-LDL (80μg/ml)加入培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí),然后將細(xì)胞固定,應(yīng)用0.3%油紅O染色,蘇木素染核,光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量以觀察泡沫細(xì)胞的形成情況。 5.為了闡明TRAIL主要通過(guò)哪種清道夫受體起作用,本研究應(yīng)用SR-AI抑制劑poly(I:C)、SR-AI siRNA、SR-BI抑制劑BLT-1分別抑制RAW264.7和THP-1細(xì)胞表面SR-AI和SR-BI的作用,然后再以TRAIL刺激細(xì)胞,觀察細(xì)胞的脂質(zhì)吞噬。 6.為確定TRAIL影響泡沫細(xì)胞形成是否通過(guò)結(jié)合DR5受體,本研究提取野生型C57BL/6小鼠和DR5-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,分別以TRAIL刺激,應(yīng)用0.3%油紅O染色以觀察泡沫細(xì)胞的形成情況。 7. TRAIL細(xì)胞通路因子的測(cè)定：RAW264.7和小鼠原代平滑肌細(xì)胞分別以TRAIL(10ng/ml)、TNF-α(20ng/ml)刺激5、10、20、30、60及120分鐘,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,應(yīng)用western-blot的方法檢測(cè)ERK1/2、p-ERK1/2、p38、 p-p38、JNK、p-JNK、FADD、TRAF2等信號(hào)蛋白的表達(dá)以檢測(cè)TRAIL與受體結(jié)合后對(duì)細(xì)胞通路的激活。應(yīng)用UPSTATE(?) Non-Radioactive Universal EZ-TFA Transcription Factor Assay試劑盒檢測(cè)NF-kB的激活。 8.為了闡明TRAIL引起的炎癥反應(yīng)及脂質(zhì)吞噬所激活的細(xì)胞通路,本研究分別應(yīng)用ERK抑制劑U0126,p38抑制劑SB202190, JNK抑制劑.NK Inhibitor II和NF-kB抑制劑Wogonin將細(xì)胞通路阻斷,再用TRAIL刺激細(xì)胞,觀察細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及脂質(zhì)吞噬。 9.檢測(cè)ob/ob巴胖小鼠及Ⅱ型糖尿病大鼠血漿及脂肪組織中TRAIL的表達(dá),與正常C57BL/6小鼠及Wistar大鼠相比較。免疫組化的方法檢測(cè)ob/ob小鼠、Ⅱ型糖尿病大鼠內(nèi)臟脂肪、人心包脂肪組織中TRAIL蛋白表達(dá)。10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用雙側(cè)t檢驗(yàn)或one-way ANOVA檢驗(yàn)。設(shè)P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1TRAIL上調(diào)平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá) TRAIL (10ng/ml)刺激血管平滑肌細(xì)胞后,自6小時(shí)起ICAM-1表達(dá)上調(diào),12小時(shí)后ICAM-1、VCAM-1與對(duì)照組相比表達(dá)顯著增高,MCP-1的表達(dá)也在24小時(shí)后上調(diào)。以TRAIL刺激RAW264.7細(xì)胞,在6小時(shí)后MCP-1、VCAM-1的表達(dá)上調(diào)。而TRAIL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)沒(méi)有影響,以終濃度10ng/ml的TRAIL刺激HUVEC細(xì)胞24小時(shí),E-選擇素、ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)與對(duì)照組相比,差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2TRAIL引起細(xì)胞的炎癥反應(yīng)依賴于p38或NF-kB的激活 與TNF-a類似,TRAIL在平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中均能夠激活MAPK通路。TRAIL刺激平滑肌細(xì)胞20分鐘后,ERK1/2、p38、JNK的磷酸化水平升高,持續(xù)120分鐘。同樣,TRAIL刺激RAW264.7細(xì)胞20分鐘后,ERK1/2、JNK的磷酸化水平升高,p-p38的水平自10分鐘起就開始升高,并持續(xù)120分鐘。 應(yīng)用U0126預(yù)處理細(xì)胞后,TRAIL仍然能夠引起平滑肌細(xì)胞的炎癥因子表達(dá)增高；應(yīng)用JNK Inhibitor II預(yù)處理細(xì)胞后,TRAIL導(dǎo)致的VCAM-1表達(dá)增高的反應(yīng)被抑制,而MCP-1、ICAM-1的表達(dá)仍上調(diào)；而應(yīng)用SB202190或Wogonin預(yù)處理細(xì)胞,TRAIL引起的MCP-1、ICAM-1、VCAM-1表達(dá)增高的反應(yīng)均被抑制。 3TRAIL可增加巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)吞噬和泡沫細(xì)胞的形成 TRAIL(10ng/ml)刺激RAW264.7細(xì)胞24小時(shí),在培養(yǎng)基中加入DiI-Ac-LDL4小時(shí)后,TRAIL刺激組RAW264.7細(xì)胞內(nèi)紅色平均熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組,至8小時(shí)時(shí)達(dá)到高峰。10ng/ml TRAIL刺激THP-1細(xì)胞24小時(shí)后(THP-1細(xì)胞提前24小時(shí)以100ng/ml PMA誘導(dǎo)分化),在培養(yǎng)基中加入DiI-Ac-LDL,細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度在8小時(shí)后明顯高于對(duì)照組。 同樣以10ng/ml TRAIL刺激RAW264.7細(xì)胞和THP-1細(xì)胞24小時(shí)后(THP-1細(xì)胞提前24小時(shí)以100ng/ml PMA誘導(dǎo)貼壁),在培養(yǎng)基中加入ox-LDL,繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí),油紅O染色顯示,TRAIL刺激組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量顯著高于對(duì)照組。 4TRAIL促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成的過(guò)程依賴于DR5 為了證明TRAIL促進(jìn)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)吞噬是否通過(guò)結(jié)合受體DR5實(shí)現(xiàn)的,我們分別提取了DR5-/-及野生型(DR5+/+)小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,以TRAIL刺激后觀察其吞噬ox-LDL的變化。DR5+/+巨噬細(xì)胞經(jīng)TRAIL刺激后,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量顯著增加,而DR5-/-巨噬細(xì)胞經(jīng)TRAIL刺激后,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量較對(duì)照組無(wú)明顯差別。 5TRAIL上調(diào)巨噬細(xì)胞表面清道夫受體SR-AI、SR-BI的表達(dá) 以0.1、1、10、100ng/ml的TRAIL刺激RAW246.7細(xì)胞24小時(shí),SR-AI和SR-BI的表達(dá)顯著增高,以10ng/ml的濃度達(dá)到最大效應(yīng)。而CD36和LOX-1的表達(dá)較對(duì)照組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然后以10ng/ml的濃度刺激RAW246.7細(xì)胞2、4、8、16、24小時(shí),結(jié)果顯示,TRAIL刺激組SR-AI和SR-BI表達(dá)持續(xù)升高,在24小時(shí)時(shí)達(dá)到高峰。最后以10ng/ml TRAIL刺激RAW246.7細(xì)胞24小時(shí),TRAIL刺激組SR-AI蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組。 以1、10、100ng/ml的TRAIL刺激THP-1細(xì)胞24小時(shí),SR-AI和SR-BI的表達(dá)顯著增高,以10ng/ml的濃度達(dá)到最大效應(yīng)。而CD36和LOX-1的表達(dá)較對(duì)照組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以lOng/ml TRAIL刺激細(xì)胞24小時(shí),SR-AI的蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組。 為了證明TRAIL上調(diào)SR-AI和SR-BI的表達(dá)是否是DR5受體依賴的,我們同樣提取了DR5-/-及野生型(DR5+/+)小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,以TRAIL刺激后觀察SR-AI和SR-BI表達(dá)的變化。DR5+/+巨噬細(xì)胞經(jīng)TRAIL刺激后,SR-AI和SR-BI的表達(dá)顯著增加,而DR5-/-巨噬細(xì)胞經(jīng)TRAIL刺激后,SR-AI和SR-BI的表達(dá)較對(duì)照組無(wú)明顯差別。 6TRAIL增加巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)吞噬依賴于SR-AI應(yīng)用SR-BI抑制劑BLT-1(5μM)預(yù)處理細(xì)胞2小時(shí)后,TRAIL (10ng/ml)刺激24小時(shí)仍能增強(qiáng)RAW246.7細(xì)胞和細(xì)胞THP-1細(xì)胞吞噬DiI-Ac-LDL的能力。而應(yīng)用SR-A抑制劑poly(I:C)(1μM)預(yù)處理后,RAW246.7細(xì)胞和細(xì)胞THP-1細(xì)胞經(jīng)TRAIL刺激其吞噬DiI-Ac-LDL卻沒(méi)有增加。以上結(jié)果提示,TRAIL增加巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)吞噬可能依賴于SR-AI。為了進(jìn)一步驗(yàn)證,我們合成了SR-AI siRNA,轉(zhuǎn)染RAW246.7細(xì)胞后,SR-AI的mRNA和蛋白表達(dá)較基礎(chǔ)水平下降70%, TRAIL (10ng/ml)刺激后表達(dá)也不再升高。與抑制劑作用相同,轉(zhuǎn)染SR-AI siRNA后TRAIL也不能促進(jìn)RAW246.7細(xì)胞吞噬Ac-LDL。 7TRAIL引起巨噬細(xì)胞脂質(zhì)吞噬增加依賴于p38或NF-kB的激活應(yīng)用U0126和.NK Inhibitor Ⅱ預(yù)處理細(xì)胞后,TRAIL仍然能夠引起RAW246.7細(xì)胞的SR-AI表達(dá)增高；而應(yīng)用SB202190或Wogonin預(yù)處理細(xì)胞,TRAIL引起的SR-AI表達(dá)增高的反應(yīng)均被抑制,這些結(jié)果提示,TRAIL引起細(xì)胞的SR-AI表達(dá)增高及脂質(zhì)吞噬反應(yīng)也依賴于p38或NF-kB的激活。 8TRAIL在肥胖動(dòng)物的脂肪組織及血清中表達(dá)增高 ob/ob肥胖小鼠血漿中TRAIL的含量顯著高于野生型小鼠,脂肪組織中TRAIL mRNA的表達(dá)也顯著增高。Ⅱ型糖尿病大鼠脂肪組織中TRAIL mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照Wistar大鼠相比顯著增高。然后,我們應(yīng)用免疫組化的方法檢測(cè)了小鼠、大鼠和人心包脂肪組織的TRAIL蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,脂肪的間質(zhì)細(xì)胞(stromal cell),而并非脂肪細(xì)胞本身,高表達(dá)TRAIL。結(jié)論 1. TRAIL促進(jìn)血管平滑肌和巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)增加； 2. TRAIL通過(guò)結(jié)合DR5受體增加巨噬細(xì)胞表面清道夫受體SR-AI的表達(dá),促進(jìn)脂質(zhì)吞噬和泡沫細(xì)胞的形成； 3. TRAIL促進(jìn)炎癥反應(yīng)及脂質(zhì)吞噬依賴于p38或NF-kB的激活； 4. TRAIL可能作為一個(gè)新的脂肪因子參與肥胖伴隨的動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R543.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 Fiona C. KIMBERLEY,Gavin R. SCREATON;Following a TRAIL: Update on a ligand and its five receptors[J];Cell Research;2004年05期

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本文編號(hào)：1993126