發(fā)布時間：2018-05-27 01:35

  本文選題：芪藶強心膠囊 + UPLC/Q-TOF-MS/MS　； 參考：《河北醫(yī)科大學》2014年博士論文

【摘要】：芪藶強心膠囊是中醫(yī)絡病理論指導研發(fā)的臨床廣泛用于慢性心力衰竭的中藥新藥，臨床使用已超過十年，為中國首個具有循證醫(yī)學研究證據(jù)、療效確切的治療慢性心衰的中成藥。芪藶強心膠囊由黃芪、附子、人參、丹參、葶藶子、澤瀉、紅花、玉竹、陳皮、桂枝、香加皮等十一味中草藥提取而成，其化學成分主要有皂苷類、黃酮類、酚酸類、生物堿等。目前關于芪藶強心膠囊研究多集中在臨床療效和藥理學研究方面，化學成分分析和質量控制研究很少，也未有藥物代謝動力學研究的報道。本文采用UPLC/Q-TOF-MS/MS作為主要分析方法，利用其快速高效、靈敏度高、特異性強的特點，對芪藶強心膠囊化學成分、血中移行成分進行定性鑒別，并對其9個主要藥效成分即烏頭生物堿進行定量分析與大鼠體內的藥代動力學研究，為進一步闡明藥效物質基礎提供理論依據(jù)和參考價值。 第一部分UPLC/Q-TOF-MS/MS法鑒定芪藶強心膠囊中化學成分 目的：建立一種超高效液相色譜與串聯(lián)四極桿飛行時間質譜儀聯(lián)用技術(UPLC/Q-TOF-MS/MS)全面快速地闡明芪藶強心膠囊的化學組成的分析方法。 方法：取芪藶強心膠囊樣品研細，取約0.3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇10mL，超聲處理30min，放冷，濾過，用50%甲醇補足至原重量后，搖勻，16000r/min離心10min，取上清夜，過濾（0.22μm），取濾液進樣分析。色譜條件：色譜柱：Phenomenex Kinetex C18100×2.1mm,2.6μm。流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序為：(0～0.5) min,10%B;(0.5～2.5) min,10%→40%B;(2.5～9)min,40%→70%B;(9～14) min,70%→90%B;(14～15) min,90%→100%B;(15～17) min,100%B;(17～17.1) min,100%→10%B;(17.1～19)min,10%B。柱溫：40℃；流速：400μL/min；進樣體積：5μL。質譜色譜條件：離子化模式為電噴霧正、負離子模式，正負離子源電壓分別為5500V/-4500V，離子源溫度為550℃，裂解電壓（DP）分別為60V/-55V，碰撞能量（CE）分別為45eV/-40eV，碰撞能量擴展（CES）分別為15eV/20eV。霧化氣體為氮氣，輔助氣1為55PSI，輔助氣2為55PSI，氣簾氣為35PSI。一級質譜母離子掃描范圍為100-1500，IDA設置響應值超過100cps的8個最高峰進行二級質譜掃描，子離子掃描范圍為50-1500，開啟動態(tài)背景扣除（DBS）。數(shù)據(jù)采集軟件：Analyst TF1.6software（AB SCEIX，USA）；數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)：Peakview1.2software（AB SCEIX，USA）。獲取UPLC/Q-TOF MS/MS全掃描質量色譜圖和源內裂解的UPLC-TOF/MS色譜圖，參照對照品信息或通過分子離子精確質量和同位素擬合度的分析確定分子式，在數(shù)據(jù)庫中檢索匹配的化合物，進而解析源內裂解的質譜圖，從而對各色譜峰進行指認。并在相同實驗條件下對芪藶強心膠囊及其組方各單味藥的色譜圖進行比對分析,歸屬色譜峰來源。 結果：從芪藶強心膠囊色譜圖中共鑒定了139個色譜峰，主要成分包括三萜皂苷類、黃酮類、生物堿類、酚酸類、萜類等。本研究比較全面地闡明了芪藶強心膠囊的化學組成，為芪藶強心膠囊的藥效物質基礎研究和質量控制奠定了基礎。 結論：該方法簡便、快速，靈敏度，可用于芪藶強心膠囊血中移行成分定性分析。 第二部分芪藶強心膠囊UPLC血清指紋圖譜研究 目的：采用超高效液相色譜(UPLC)法建立芪藶強心膠囊血清指紋圖譜，為芪藶強心膠囊血清藥物化學及藥效物質基礎研究提供依據(jù)。 方法：大鼠灌胃給藥制備含藥血清，采用Waters ACQUITY UPLCBEH C18色譜柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，流動相乙腈-0.1%甲酸水，梯度洗脫，流速0.5mL·min-1，柱溫40℃，檢測波長280nm，分析芪藶強心膠囊大鼠含藥血清，并與相同條件下空白血清、體外全方及其11個單味藥圖譜比對，對色譜峰歸屬進行分析。 結果：建立了芪藶強心膠囊的UPLC血清指紋圖譜，共標定了13個共有峰，指認了其中4個共有峰，均為藥源性成分，來自香加皮。10批芪藶強心膠囊血清指紋圖譜的相似度均在0.868～1.000。 結論：本研究建立的方法準確、可靠、重現(xiàn)性好，可用于芪藶強心膠囊血清藥物化學及藥效物質基礎的研究。 第三部分UPLC/Q-TOF-MS/MS法鑒定芪藶強心膠囊血中移行成分 目的：建立一種超高效液相色譜與串聯(lián)四極桿飛行時間質譜儀聯(lián)用技術(UPLC/Q-TOF-MS/MS)全面快速地闡明芪藶強心膠囊血中移行成分的分析方法。 方法：采用UPLC/Q-TOF-MS/MS方法，對比芪藶強心膠囊、空白血清、芪藶強心膠囊含藥血清總離子流圖，質譜圖等信息，通過對比各色譜峰的保留時間及質譜圖裂解規(guī)律，確認大鼠灌胃芪藶強心膠囊內容物后血中移行成分及其歸屬。 結果：大鼠口服芪藶強心膠囊后血中共發(fā)現(xiàn)61個入血成分，其中34個為芪藶強心膠囊中原形成分，27個為原形藥物的代謝產(chǎn)物。本研究將為闡明芪藶強心膠囊藥效物質基礎提供依據(jù)。 結論：該方法簡便、快速，靈敏度，可以用于芪藶強心膠囊化學成分定性分析。 第四部分UPLC/Q-TOF-MS/MS法快速測定芪藶強心膠囊及其附子中的9個烏頭類生物堿成分含量 目的：建立一種簡便、準確、可靠的UPLC/Q-TOF-MS/MS分析方法，用于芪藶強心膠囊和附子中9個烏頭類生物堿成分的含量測定。 方法：取芪藶強心膠囊樣品研細，取約0.3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇10mL，超聲處理30min，放冷，濾過，用50%甲醇補足至原重量后，搖勻，16000r/min離心10min，取上清夜，過濾（0.22μm），取濾液進樣分析。色譜條件：色譜柱：Phenomenex Kinetex C18100×2.1mm,2.7μm。流動相由0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）組成，梯度洗脫：0~1min（10%B）,1~2min（10-30%B）,2~6min（30 40%B）,6~7min（40 100%B）,7~8min（100%B),8~8.1min（100 10%B),8.1~10min（10%B).柱溫：40℃；流速：400μL/min；進樣體積：5μL。每次進樣預平衡5min，再進行梯度洗脫。質譜色譜條件：離子噴霧電壓，5.5KV；離子源溫度,550℃;解簇電壓(DP)，60V和碰撞能量(CE)，35eV。氮氣為霧化氣和輔助氣，霧化氣50psi，輔助氣50psi，氣簾氣35psi。在m/z100-1500amu質量范圍ESI正離子模式下進行全掃描，積累時間250ms。IDA采用標準：每個分析物，超過100cps的八個最強的碎片離子在100~1500amu質量范圍內進行子離子掃描，累積時間70ms。碰撞電壓差20eV，動態(tài)背景扣DBS開啟。自動校準系統(tǒng)(CDS)對MS和MS/MS自動進行調諧和校正。數(shù)據(jù)獲取和處理分析采用Analyst TF1.6軟件、PeakView1.2軟件和MultiQuant2.1.1軟件。 結果：在一定濃度區(qū)間內9種分析物的線性關系良好，r20.9940；所有分析物定量限LOQ范圍0.03~0.50ng/mL，日內精密度、日間精密度RSD均小于3.38%，重復性試驗RSD均小于4.23%。加樣回收率在95.35~106.21%范圍內，4℃放置24h穩(wěn)定性良好。芪藶強心復方配伍改變了復方中附子的上述9個生物堿的構成比和總生物堿含量，毒性最大的DDAs（AC、MA、HA）含量明顯減少，而MDAs相對含量顯著增高。 結論：該方法簡便快速，靈敏度高，選擇性好，可用于芪藶強心膠囊和附子中9個烏頭類生物堿成分的含量測定，并為芪藶強心膠囊的質量控制提供了新的分析方法和手段。 第五部分基于UPLC/Q-TOF-MS/MS的芪藶強心膠囊中9個烏頭類生物堿大鼠體內的藥代動力學研究 目的：建立一種UPLC/Q-TOF-MS/MS的芪藶強心膠囊中9個烏頭類生物堿大鼠體內藥代動力學研究分析方法，建立其藥-時曲線，獲得藥動學參數(shù)與特征，為臨床用藥提供參考。 方法：大鼠禁食不禁水12h，灌胃給予芪藶強心膠囊內容物，分別于給藥前和給藥后0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48h乙醚麻醉腹主動脈取血，至經(jīng)肝素處理的離心管中，3000r/min離心10min，分離血漿，采用固相萃取法預處理樣品，內標為地西泮。PhenomenexKinetex C18100×2.1mm,2.7μm；流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序為0~1min，5%B；1~3min，5%→10%B；3~13min，10%→60%B；13~13.5min，60%→5%B；13.5~15min，5%B。柱溫：40℃，流速：400μL/min。質譜條件離子化模式：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；TOF-MS質譜掃描范圍為50-1500Da，MS/MS質譜掃描范圍為50-1500Da，噴霧電壓（IS）為5500V；霧化溫度為550℃，霧化氣（Gas1, N2）為50psi，輔助氣（Gas2, N2）為50psi，，氣簾氣（Cur, N2）為35psi，裂解電壓(DP)60V，碰撞能量（CE）44V，碰撞能量擴展（CES）15V。準確質量數(shù)用APCI Positive校正液（利血平）校正。數(shù)據(jù)獲取和處理分析采用Analyst TF1.6軟件、 PeakView1.2軟件和MultiQuant2.1.1軟件。藥動學數(shù)據(jù)采用非室模型處理，用excel軟件分析數(shù)據(jù)。達峰時間(Tmax)和峰濃度(Cmax)由血藥濃度曲線直接獲得。消除常數(shù)（k）由曲線最后4個點的斜率的對數(shù)計算得到。消除半衰期T1/2=0.693/k。 結果：血漿中附子靈、尼奧林、塔拉地薩敏、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿在0.25～75ng/mL范圍內線性關系良好（r2≥0.9946），最低定量限（LLOQ）≤0.247ng/mL。日內、日間精密度的相對標準偏差（RSD）0.4%~5.0%，相對誤差（RE）為-2.4%~6.7%。平均提取回收率為85.70%~97.37%，基質效應分別介于94.63~99.32%。大鼠灌胃芪藶強心膠囊內容物后附子靈、尼奧林、塔拉地薩敏、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿在體內吸收迅速，迅速分散，藥時曲線均出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，與文獻報道相符；消除相比較平緩，我們推測與生物堿類本身代謝特點、復方配伍以及給藥劑量高有關。 結論：該法靈敏度高、選擇性好、精密度好，可用于大鼠灌胃芪藶強心膠囊后血漿中附子靈、尼奧林、塔拉地薩敏、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿的藥動學研究。根據(jù)藥動學結果由此可推斷芪藶強心膠囊復方配伍可能影響活性成分的藥動學特征。
[Abstract]:Qili Qiangxin capsule is a new traditional Chinese medicine for treating chronic heart failure . It has been used for more than 10 years . It is the first Chinese medicine for the treatment of chronic heart failure with evidence of evidence of evidence for evidence - based medicine . It is characterized by high efficiency , high sensitivity and strong specificity .


Determination of Chemical Constituents in Qiliqiangxin Capsules by UPLC / Q - TOF - MS / MS


Objective : To establish an ultra - high performance liquid chromatography and tandem quadrupole time mass spectrometer ( UPLC / Q - TOF - MS / MS ) .


Methods : The samples of Qiliui Qiangxin Capsule were ground and weighed about 0.3 g , precisely weighed , placed in a conical flask , 10 mL of methanol , 30 min of ultrasonic treatment , cooling , filtering , adding 50 % methanol to the original weight , shaking , adding water solution ( A ) - acetonitrile ( B ) at 16000r / min . The chromatographic conditions were as follows : ( 0 ~ 0.5 ) min , 10 % B ; ( 14 ~ 15 ) min , 90 % 鈫

本文編號：1939840