本文選題：聽(tīng)覺(jué)剝奪 + 軸突生長(zhǎng)抑制蛋白�。� 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的： 本研究通過(guò)建立雙側(cè)耳蝸手術(shù)損毀所致聽(tīng)覺(jué)剝奪（AuditoryDeprivation, AD）動(dòng)物模型，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中三種重要軸突生長(zhǎng)抑制蛋白勿動(dòng)蛋白多肽因子-A（Nogo-A）、髓鞘相關(guān)糖蛋白（MAG）、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白（Omgp）及其共同受體Nogo-66受體（NgR）在聽(tīng)皮層中表達(dá)水平的變化情況進(jìn)行觀(guān)察，探究軸突生長(zhǎng)抑制蛋白與聽(tīng)皮層可塑性之間的關(guān)系，并為聽(tīng)皮層可塑性機(jī)制的進(jìn)一步探索提供一定的理論依據(jù)。 方法： 選取72只生后兩周齡健康雄性且耳廓反射正常的SD乳鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各36只。實(shí)驗(yàn)組乳大鼠麻醉后，施行雙側(cè)耳蝸損毀手術(shù)，對(duì)照組在相同條件下，只做雙側(cè)耳后切口，不損壞耳蝸。根據(jù)動(dòng)物術(shù)后飼養(yǎng)的時(shí)間不同將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組又分別分為2、4、6、8周四個(gè)小組，每個(gè)小組9只動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均置于溫度、濕度適宜的屏蔽環(huán)境中喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別于術(shù)后兩周進(jìn)行ABR檢測(cè)，將引出Ⅲ波等重復(fù)波形的最小刺激強(qiáng)度定為ABR反應(yīng)閾，判斷動(dòng)物模型是否成功建立。采用蛋白免疫印跡技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、以及免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)分別于術(shù)前及術(shù)后2、4、6、8周檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠聽(tīng)皮層Nogo-A、MAG、Omgp、NgR的蛋白及mRNA表達(dá)水平的變化。 結(jié)果： 1耳蝸損毀手術(shù)結(jié)果： 術(shù)后大鼠進(jìn)食、飲水等活動(dòng)正常，兩周后無(wú)頭頸歪斜，拎尾懸空能保持平衡，無(wú)原地反復(fù)轉(zhuǎn)圈等前庭功能損害的表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)組大鼠較正常組大鼠行動(dòng)遲緩，耳廓反射消失且對(duì)噪聲刺激不敏感。 2ABR檢測(cè)結(jié)果： ABR測(cè)試結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠雙耳40SPL dB能引出重復(fù)波形，聽(tīng)閾為40dB，而實(shí)驗(yàn)組大鼠雙耳90SPL dB無(wú)法引出重復(fù)波形，聽(tīng)閾大于90dB，按依據(jù)1980年WHO對(duì)耳聾的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)聽(tīng)聽(tīng)閾超過(guò)90dB為全聾，本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明耳蝸損毀手術(shù)所致大鼠聽(tīng)覺(jué)剝奪動(dòng)物模型建造成功。 3免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果： Nogo-A、MAG、Omgp、NgR在大鼠聽(tīng)皮層的神經(jīng)元與腦內(nèi)神經(jīng)纖維髓鞘中有表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)多細(xì)胞形態(tài)，有神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)、條索狀神經(jīng)纖維髓鞘形態(tài)或兩者共存。Nogo-A及Omgp的陽(yáng)性信號(hào)分布在細(xì)胞膜和神經(jīng)纖維髓鞘，呈現(xiàn)出神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)及條索狀神經(jīng)纖維髓鞘形態(tài)。MAG陽(yáng)性細(xì)胞僅為條索狀神經(jīng)纖維形態(tài)，陽(yáng)性信號(hào)在神經(jīng)纖維髓鞘分布，NgR陽(yáng)性細(xì)胞僅為神經(jīng)元形態(tài)，陽(yáng)性信號(hào)在細(xì)胞膜及胞質(zhì)中均有分布。對(duì)2、4、6、8周實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)得：實(shí)驗(yàn)組Nogo-A蛋白平均光密度值A(chǔ)OD依次為0.254、0.368、0.591、0.510，，對(duì)照組依次為0.233、0.313、0.427、0.368。實(shí)驗(yàn)組NgR AOD值依次為0.390、0.445、0.602、0.507，對(duì)照組依次為0.346、0.416、0.529、0.452。實(shí)驗(yàn)組MAG AOD值依次為0.366、0.471、0.642、0.513，對(duì)照組依次為0.318、0.418、0.603、0.442。實(shí)驗(yàn)組Omgp AOD值依次為0.304、0.481、0.644、0.520，對(duì)照組為0.270、0.415、0.560、0.424。激光共聚焦掃描成像顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組Nogo-A、MAG、Omgp、NgR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均有隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加的趨勢(shì)，且三種軸突生長(zhǎng)抑制蛋白Nogo-A、MAG、Omgp及其受體NgR增多趨勢(shì)相似，其陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均于術(shù)后6周左右達(dá)到峰值，且其實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，蛋白表達(dá)的平均光密度值顯著增加。 4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果： Nogo-A、MAG、Omgp及其受體NgR mRNA的熔解曲線(xiàn)分析圖可以看出，各圖中僅出現(xiàn)目標(biāo)基因以及內(nèi)參GAPDH的兩個(gè)單一峰，無(wú)雜峰和其他產(chǎn)物出現(xiàn)的非特異性熒光，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)定量準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組Nogo-A、MAG、Omgp、NgR mRNA的原始Ct值均有明顯下降趨勢(shì)，Ct值越低，表達(dá)量越高。Nogo-A和Omgp mRNA的Ct值于術(shù)后6周降至最低點(diǎn)，MAG和NgR mRNA的Ct值于術(shù)后4周降至最低點(diǎn)，而且Nogo-AmRNA術(shù)后各實(shí)驗(yàn)組Ct值明顯低于各對(duì)照組。NgR與MAG mRNA術(shù)后2、4周實(shí)驗(yàn)組Ct值明顯低于其對(duì)照組，Omgp mRNA術(shù)后2、4、6周的實(shí)驗(yàn)組Ct值明顯低于其對(duì)照組。以對(duì)照2周組大鼠做校準(zhǔn)，根據(jù)2-Ct法計(jì)算實(shí)驗(yàn)各小組目的基因的相對(duì)表達(dá)量得到：實(shí)驗(yàn)組2、4、6、8周Nogo-A mRNA的2-Ct均值分別為1.323，2.085，2.792，2.077，NgR為2.028，2.276，1.833，1.688， MAG為1.351，2.809，1.906，1.331，Omgp為1.298，1.616，2.389，1.878。結(jié)合目的基因原始Ct值和2-Ct值可以看出Nogo-A、MAG、Omgp及其受體NgR mRNA無(wú)論手術(shù)與否表達(dá)均有隨時(shí)間增高趨勢(shì)，MAG和NgR mRNA于術(shù)后4周達(dá)到峰值，Nogo-A和Omgp mRNA于術(shù)后6周達(dá)到峰值，達(dá)峰后目的基因表達(dá)均開(kāi)始下降，且實(shí)驗(yàn)組四個(gè)目的基因表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組。 5Western Blot檢測(cè)結(jié)果： 在200kD，100kD，25kD，66kD處分別呈現(xiàn)Nogo-A、MAG、Omgp、NgR特異性蛋白表達(dá)條帶。以GAPDH（37kD）作為內(nèi)參校正上樣量的一致性，2、4、6、8周實(shí)驗(yàn)組Nogo-A灰度比均值分別為0.275、0.389、0.460、0.343，對(duì)照組為0.110、0.131、0.162、0.122。實(shí)驗(yàn)組NgR為0.097、0.107、0.149、0.120，對(duì)照組為0.065、0.070、0.081、0.072。實(shí)驗(yàn)組MAG為0.248、0.365、0.478、0.327，對(duì)照組為0.195、0.257、0.309、0.276。實(shí)驗(yàn)組Omgp為0.173、0.320、0.405、0.3445，對(duì)照組為0.092、0.257、0.309、0.276。結(jié)果顯示Nogo-A、MAG、Omgp及其受體NgR的蛋白表達(dá)隨年齡增長(zhǎng)有相似的增加趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均在6周組出現(xiàn)峰值，隨后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組表達(dá)均開(kāi)始下調(diào)。Nogo-A、Omgp、NgR蛋白表達(dá)2、4、6、8周實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MAG蛋白表達(dá)4、6周實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比表達(dá)量均明顯增高。 結(jié)論： 1雙側(cè)耳蝸損毀手術(shù)是一種建立聽(tīng)覺(jué)剝奪大鼠模型的既穩(wěn)定又可靠的方法。 2三種軸突生長(zhǎng)抑制蛋白及其受體在大鼠聽(tīng)皮層有表達(dá)。 3正常發(fā)育的大鼠在聽(tīng)覺(jué)發(fā)育關(guān)鍵期聽(tīng)皮層即有軸突生長(zhǎng)抑制蛋白Nogo-A、MAG、Omgp及其受體NgR的表達(dá)，隨生長(zhǎng)發(fā)育表達(dá)逐漸升高并于生后4～6周達(dá)到峰值，隨后表達(dá)開(kāi)始下調(diào)，這可能是因?yàn)樯蟀l(fā)育早期以及聽(tīng)覺(jué)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期，軸突生長(zhǎng)抑制蛋白及其受體介導(dǎo)軸突伸長(zhǎng)，對(duì)神經(jīng)纖維及軸突的作用以修復(fù)、促進(jìn)為主，隨著發(fā)育至成年以后，軸突生長(zhǎng)抑制蛋白及受體的作用逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐种戚S突過(guò)度生長(zhǎng)。 4耳蝸損毀所致聽(tīng)覺(jué)剝奪的大鼠，外周聽(tīng)器損傷后，聽(tīng)皮層軸突生長(zhǎng)抑制蛋白Nogo-A、MAG、Omgp及其受體NgR的表達(dá)與正常發(fā)育至相同時(shí)間的大鼠相比顯著升高，達(dá)峰時(shí)間與正常發(fā)育大鼠相似但表達(dá)量明顯增高。這可能是因?yàn)槎亾p毀導(dǎo)致外周聽(tīng)器損傷初期，軸突生長(zhǎng)抑制蛋白及其受體主要參與修復(fù)神經(jīng)纖維、促進(jìn)神經(jīng)及軸突生長(zhǎng)的過(guò)程，當(dāng)新的突觸與髓鞘逐步形成，聽(tīng)皮層逐步建立起新的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)后，表達(dá)開(kāi)始逐漸下調(diào)，此后對(duì)神經(jīng)纖維及軸突的作用以抑制過(guò)度生長(zhǎng)為主，這也說(shuō)明外周聽(tīng)器損傷確實(shí)可導(dǎo)致高級(jí)聽(tīng)覺(jué)中樞的可塑性變化，而且軸突生長(zhǎng)抑制蛋白及其受體參與了聽(tīng)皮層神經(jīng)元可塑性調(diào)控，同時(shí)也間接證明了大鼠聽(tīng)皮層是一個(gè)具有高度可塑性的大腦皮層特異性功能區(qū)域。
[Abstract]:Objective:
In this study, by establishing AuditoryDeprivation (AD) animal model of bilateral cochlear surgery, three important axon growth inhibitory protein (Nogo-A), myelin related glycoprotein (MAG), oligodendrocyte myelin glycoprotein (Omgp) and its common receptor Nogo-66 receptor (NgR) in the central nervous system were established in the central nervous system. To observe the changes in the level of expression in the auditory cortex and explore the relationship between the axon growth inhibitory protein and the plasticity of auditory cortex, and provide some theoretical basis for the further exploration of the mechanism of auditory cortex plasticity.
Method錛

本文編號(hào)：1871185