本文選題：金納米簇(AuNCs) + 細胞攝取��； 參考：《吉林大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景:周圍神經(jīng)損傷所導(dǎo)致的肢體功能障礙在臨床中較為常見。即便是良好的手術(shù)治療,結(jié)果往往是恢復(fù)不理想,甚至一些患者不能恢復(fù)。目前,可用于周圍神經(jīng)損傷術(shù)后評價其再生水平的方法只是簡單的臨床檢查,比如肌力的評價、感覺功能檢查、Tinel's征和肌電圖,這些檢查方法多具有主觀性或缺乏準(zhǔn)確性。所以,準(zhǔn)確地評估周圍神經(jīng)再生水平有助于預(yù)測術(shù)后恢復(fù)的效果。在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域中一個非常傳統(tǒng)的神經(jīng)解剖示蹤技術(shù)可以直接觀測到神經(jīng)。傳統(tǒng)的神經(jīng)示蹤劑,如辣根過氧化物酶、細菌毒素和熒光染料等,具有一定的局限性,包括耗時的免疫組化步驟、復(fù)雜的程序、熒光信號差和易光漂白。目前,有許多研究文獻報道關(guān)于熒光納米材料在生物成像和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。根據(jù)我們先前關(guān)于碳點(碳納米點、交聯(lián)柔性聚集體的聚合物點、納米石墨烯碳核結(jié)構(gòu)的石墨烯量子點)的研究經(jīng)驗,我們在本次研究中介紹了金納米團簇(AuNCs),其優(yōu)越的熒光激發(fā)/發(fā)射波長(紅色熒光)克服了組織和細胞的自發(fā)熒光,自發(fā)熒光是細胞成像和神經(jīng)示蹤領(lǐng)域中的重要特征。對這種納米粒子感興趣的原因在于它們優(yōu)良的光學(xué)特征、化學(xué)穩(wěn)定性、低毒、溶解性好、抗光漂白和易于表面修飾。目前半導(dǎo)體量子點被用于生物傳感器和生物成像領(lǐng)域。然而,其重金屬毒性在臨床應(yīng)用中仍存在較大的局限性。因此,與半導(dǎo)體量子點相比,這些納米粒子具有的生物相容性更具有前景。本文著重研究其細胞行為、體內(nèi)毒性和基于金納米團簇的神經(jīng)示蹤劑的研制。在本項研究中,詳細介紹了 AuNCs在大鼠嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)的行為學(xué)特點。用于研究納米粒子的細胞攝取機制和內(nèi)吞途徑的工具包括共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)和流式細胞儀(FACS)。然后,利用不同的內(nèi)吞標(biāo)記和細胞器特異染料,通過CLSM觀察可研究細胞內(nèi)的運輸機制、亞細胞器分布和共定位,同時通過透射電子顯微鏡(TEM)可以直接觀察到納米粒子在細胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)。我們的研究結(jié)果顯示,AuNCs具有低毒性和在神經(jīng)細胞內(nèi)的有效內(nèi)化。其細胞攝取具有劑量、時間和能量依賴性。它們主要分布在溶酶體結(jié)構(gòu)內(nèi),但是未在細胞核內(nèi)觀察到。在證明AuNCs在體內(nèi)、體外低毒性后,基于它們的細胞學(xué)行為,通過其與霍亂毒素B亞單位結(jié)合研制出用于神經(jīng)示綜的熒光生物探針�；魜y毒素B亞單位是一個無毒的傳統(tǒng)神經(jīng)示蹤劑。通過EDC/NHS反應(yīng)將霍亂毒素B亞單位和金納米團簇連接在一起。作為逆行神經(jīng)示蹤劑的應(yīng)用證明,它可以在大鼠周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元內(nèi)逆行運輸。材料與方法:研究的第一部分內(nèi)容是關(guān)于AuNCs在大鼠嗜鉻細胞瘤細胞(高分化PC12)的生物學(xué)行為。微小的AuNCs通過刻蝕技術(shù)和電化學(xué)交換反應(yīng)將谷胱甘肽包裹AuNCs的表面。應(yīng)利用Synergy HT Microplate reader通過MTT實驗檢測PC12細胞在不同濃度的AuNCs的細胞毒性,從0.025mg/ml-0.3mg/ml分別孵育24h,48h和72h。細胞培養(yǎng):PC12(高分化)在加有100%FBS、100U/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素的DMEM中培養(yǎng),在37℃和5%CO2的條件下孵育。PC12細胞種植于96孔板培養(yǎng)皿,每孔約1x104個細胞,在37℃和5%CO2的條件下孵育進行MTT實驗。通過FACS研究細胞攝取的機制,PC12細胞在6孔板培養(yǎng),每孔約5 x 105個細胞;利用CLSM研究時,1 x 104個細胞培養(yǎng)于35mm激光共聚焦培養(yǎng)皿(GBD)。然后,對于AuNCs,的攝取機制和內(nèi)吞途徑的研究,濃度按0.2mg/ml在PC12細胞中孵育規(guī)定的時間。研究工具包括激光共聚焦顯微鏡(CLSM),流式細胞儀(FACS)。利用不同的內(nèi)吞標(biāo)記物和細胞器特異性染料通過CLSM研究細胞內(nèi)運輸,亞細胞器分布和共定位。細胞器特異性染料包括LysoTracker Green和MitoTracker Green,他們分別標(biāo)記溶酶體和線粒體。最后,AuNCs在PC12細胞孵育72h,制作電鏡標(biāo)本,并通過透射電子顯微鏡(TEM)觀察。研究的第二部分是關(guān)于AuNCs活體毒性,在應(yīng)用于活體之前先研究它的生物相容性。雄性Wistar大鼠,體重為220-280g。15只大鼠分成三組(每組五只),其中,低劑量組和高劑量組分別為注射0.2ml的50mg/ml和100mg/ml的AuNCs,通過腹腔注射,連續(xù)注射7天。對照組為注射0.2ml的氯化鈉鹽水。監(jiān)測大鼠體重和活動的改變。大鼠在第八天用10%的水合氯醛麻醉,腹主動脈抽血進行血液生化學(xué)檢測。切取腦、心、腎、肝、脾、肺后,通過組織切片和蘇木精-伊紅染色進行組織學(xué)檢查。研究的第三部分是關(guān)于AuNCs作為神經(jīng)示蹤劑的應(yīng)用。首先,進行體內(nèi)熒光攝取和穩(wěn)定性試驗,11μL的AuNCs(10mg/ml)在Wistar大鼠股部中點直接注射到坐骨神經(jīng)外膜下。大鼠分別在注射后7天和28天猝死。坐骨神經(jīng)注射位點取材,制作切片,利用熒光顯微鏡在UV激發(fā)下進行觀察。然后,霍亂毒素B亞單位,一個非毒性的傳統(tǒng)神經(jīng)示蹤劑被應(yīng)用于連接AuNCs。通過EDC/NHS反應(yīng)將霍亂毒素B亞單位與金納米簇結(jié)合(CTB-AuNC)。CTB-AuNC的結(jié)合和性質(zhì)通過SDS-PAGE凝膠電泳,FTIR,紫外吸收光譜和Zeta電位實驗檢測。最后,結(jié)合后的CTB-AuNCs應(yīng)用于逆行熒光納米神經(jīng)示蹤劑。成年Wistar大鼠用水合氯醛麻醉,大鼠雙側(cè)股部暴露后分離坐骨神經(jīng),右側(cè)坐骨神經(jīng)神經(jīng)外膜下注射5μL 1%CTB-AuNCs,,左側(cè)坐骨神經(jīng)作為對照組于神經(jīng)外膜下注射5 μLof 1%生理鹽水。CTB-AuNCs注射后6天,大鼠用10%的水合氯醛麻醉,通過左心室0.9%氯化鈉鹽水灌注1小時和4%多聚甲醛灌注2小時。雙側(cè)L4和L5背根神經(jīng)節(jié)和脊髓腰段取材,置于4%多聚甲醛3～4小時,然后放置在30%蔗糖的PBS緩沖液中過夜。20μ米厚的L4和L5背根神經(jīng)節(jié),坐骨神經(jīng)注射部位和注射部位接近背根神經(jīng)節(jié)處采用冰凍切片機縱切,然后在熒光顯微鏡下(Olympus BX51)采用紫外激發(fā)模式觀察CTB AUNC熒光。陽性結(jié)果為CTB AuNCs在背根神經(jīng)節(jié)和注射部位以近部分可以觀測到熒光成像,并行免疫組織化學(xué)染色,切片在光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果:AuNCs的制備是在Ag納米粒子與谷胱甘肽(GSH)配體制備后,然后通過電流交換反應(yīng),與HAuC14刻蝕反應(yīng)。合成的熒光AuNCs通過透射電子顯微鏡(TEM)觀察其形態(tài)。合成的AuNCs熒光顆粒大小呈球形,均勻,平均粒徑小于2.5納米。高分辨透射電子顯微鏡顯示2.35A晶格間距。由于配體GSH形成了具有優(yōu)良穩(wěn)定性的Au-S鍵作為保護層,使納米顆粒沒有形成較大納米尺寸和聚集。在PC12細胞中AuNCs的細胞毒性:在濃度25,50,100,200和300μg/mL的AuNCs下分別孵育24h和48h,細胞的存活率在200μg/mL時仍維持在90%以上,細胞的存活率在300μg/mL時仍維持在80%以上。在同樣的濃度下,孵育較長時間達72h,細胞的存活率在200μg/mL時仍維持在80%以上,存活率在300μg/mL濃度時下降。AuNCs的細胞內(nèi)攝取和亞細胞器分布:PC12細胞和不同濃度AuNCs培養(yǎng)72h后,測量平均熒光強度,顯示AuNCs的平均熒光強度與濃度(50-200μg/mL)呈線性相關(guān),分別用FACS和CLSM檢測。AuNCs在亞細胞器的分布顯示AuNCs主要運輸?shù)饺苊阁w,與LysoTracker green特異性共定位。然而,AuNCs與MitoTracker green卻沒有共定位。這個現(xiàn)象證明了 AuNCs的亞細胞器分布主要是溶酶體。通過TEM觀察PC12細胞的超微結(jié)構(gòu)的攝取和分布。TEM圖像顯示,細胞膜通過晶格的形式包裹AuNCs(密度反差粒子),這表明細胞內(nèi)吞作用是存在的。此外,在胞漿內(nèi)吞小泡或早期內(nèi)涵體的形成,并在這些結(jié)構(gòu)中可觀察到電子密度顆粒的AuNCs。體內(nèi)毒性試驗結(jié)果:AuNCs毒性的體內(nèi)毒性研究是通過成年雄性大鼠完成的。他們的活動、進食和飲水習(xí)慣,皮膚顏色改變和精神狀態(tài)在所有組別內(nèi)正常,并且沒有死亡。此外,對照組和實驗組在體重方面沒有明顯的差異。分析血常規(guī)、紅細胞、血紅蛋白、紅細胞壓積、血小板計數(shù)等常見指標(biāo)。這些血細胞分析指標(biāo)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義,表明AuNCs對大鼠血細胞無明顯毒性作用。血清生化檢查顯示肝功能指標(biāo),包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白、球蛋白,在三組變化均在正常范圍內(nèi),提示所有組大鼠肝功能是正常的。腎功能指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,如血清肌酐(Cr)、血尿素氮(BUN)、尿酸(UA),這表明AuNCs對腎功能無明顯損害。各主要臟器組織學(xué)檢查顯示在連續(xù)給藥AuNCs(50mg/kg和100mg/kg)7天后肝臟,脾,腎,肺,大腦和心臟無明顯的病理變化。即使在AuNCs100100mg/kg較高濃度下,體內(nèi)的毒性與對照組比較仍不顯著,表明其較好的生物相容性和良好的臨床應(yīng)用前景。CTB-AuNCs的結(jié)合和表征結(jié)果:通過TEM檢測分析的形態(tài)和結(jié)構(gòu)表明,新合成的CTB AuNCs復(fù)合物的平均尺寸約為5.5 nm,明顯大于2.5 nm的單AuNCs,顆粒尺寸變得不均勻,納米顆粒聚集形成一個較大的顆粒。這是由于Au納米粒子表面豐富的GSH配體。多個CTB與AuNCs結(jié)合,與透射電鏡照片觀察到的結(jié)果一致。在確定了 CTB-AuNCs結(jié)構(gòu)后,其光學(xué)性能的進一步檢查表明CTB-AuNCs復(fù)合體的熒光光譜的最佳激發(fā)波長是467nm。在這個激發(fā)波長激發(fā)下,其發(fā)射波長為607nm,表明Au納米粒子的熒光峰在結(jié)合CTB后沒有改變。合成的CTB-AuNCs溶液澄清透明,分散。紫外光下,溶液出現(xiàn)明亮的紅色熒光,表明CTB AuNCs復(fù)合體保持原來的AuNCs熒光性質(zhì)。SDS-PAGE表明CTB-AuNCs紫外光照射下在10kDa和15 kDa之間呈強熒光信號帶。CTB的分子量為11.6kDa,AuNCs在紫外光照射下能發(fā)出強烈的熒光,所以此帶可以證實CTB-AuNCs成功的結(jié)合。AuNCs體內(nèi)熒光穩(wěn)定性結(jié)果:10 μL AuNCs(10mg/ml)注射在左側(cè)股部坐骨神經(jīng)中點神經(jīng)外膜下。7天之后,左、右坐骨神經(jīng)切除,固定,并用冰凍切片機切取20μM組織切片制作冰凍切片。組織切片移置在載玻片上,在紫外光激發(fā)下用熒光顯微鏡觀察。坐骨神經(jīng)對照組觀察為藍色熒光,注射AuNCs的坐骨神經(jīng)觀察為明亮的紅色熒光神經(jīng)纖維。AuNCs熒光的長期維持的檢測試驗:經(jīng)過28天的AuNCs注射的坐骨神經(jīng),行坐骨神經(jīng)注射部位冰凍切片并用熒光顯微鏡觀察,可見明亮的紅色熒光神經(jīng)纖維,證明注射部位仍可有AuNCs沉積。CTB-AuNCs作為PNS逆行神經(jīng)示蹤劑的結(jié)果:5 μL of 1%CTB-AuNCs注射在右股部坐骨神經(jīng)的中點。5 μL 0.9%生理鹽水在左側(cè)坐骨神經(jīng)同樣水平位置注射作為對照。6天之后,左、右坐骨神經(jīng)和L5背根神經(jīng)節(jié)(DRG)切除后行冰凍切片,CTB-AuNCs注射部位和近神經(jīng)根部位呈亮紅色熒光。此外,CTB-AuNCs熒光信號雖然在L4DRG觀察很少,卻表明坐骨神經(jīng)的傳入纖維進入脊髓通過L4和L5神經(jīng)根。此外,CTB-AuNCs標(biāo)記的神經(jīng)元可以在右側(cè)的L3-L5縱剖面發(fā)現(xiàn)。為了證實CTB-AuNCs熒光信號,熒光陽性切片用于進一步的CTB的免疫組化染色。結(jié)果與CTB-AuNCs熒光信號的分布一致。對照坐骨神經(jīng)側(cè)在紫外光激發(fā)下,除了正常的藍色自發(fā)熒光外沒有其他任何的熒光。作為逆行示蹤劑的應(yīng)用表明,它可以逆行運輸?shù)酱笫蟮闹車窠?jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元。結(jié)論:在這項研究中,我們已經(jīng)研究了細胞的生物學(xué)行為,在體外和在體內(nèi)的毒性以及與CTB結(jié)合(CTB-AuNC)作為納米神經(jīng)示蹤劑的應(yīng)用潛能。AuNCs的重點是超微結(jié)構(gòu)、可調(diào)節(jié)、使紅色熒光(更高的發(fā)射波長)接近近紅外區(qū)、毒性低、生物相容性好、高的光穩(wěn)定性和抗光漂白,這些特點使其優(yōu)于傳統(tǒng)的有機染料和我們之前研究的碳點和最近研究熱門的量子點。首先,AuNC細胞攝取具有劑量依賴性和時間依賴性,攝取的AuNCs運輸主要通過早期和晚期內(nèi)涵體運輸?shù)饺苊阁w。細胞的攝取較為緩慢,可能由于它與細胞膜表面的蛋白之間的相互作用導(dǎo)致的,此現(xiàn)象存在爭議。其次,AuNCs體內(nèi)毒性結(jié)果表現(xiàn)為低毒性,這是對于任何新的納米材料動物成像中的應(yīng)用的重要前提。體內(nèi)的AuNCs熒光穩(wěn)定性可被四周的體內(nèi)熒光證明。第三,霍亂毒素B亞單位(一種逆行運輸?shù)纳窠?jīng)多肽)與AuNCs連接,應(yīng)用它作為一種新的基于AuNCs熒光的熒光神經(jīng)示蹤劑。谷胱甘肽修飾的AuNCs具有很強的熒光強度、超小尺寸、穩(wěn)定的光學(xué)和化學(xué)性能、易于表面修飾、細胞毒性低、生物相容性好。因此,它適合于熒光標(biāo)記,但沒有神經(jīng)源性特異性,所以我們選擇了霍亂毒素B亞單位(CTB)為載體,結(jié)合CTB與AuNCs。新的熒光納米神經(jīng)示蹤劑(CTB-AuNCs)通過與AuNCs結(jié)合制備,注射于大鼠股部坐骨神經(jīng)水平,可以被PNS外周神經(jīng)元攝取,并運輸?shù)缴窠?jīng)元的細胞體。在CTB-AuNCs注射后6天,熒光信號出現(xiàn)在L4、L5背根神經(jīng)節(jié),并且經(jīng)免疫組化進一步證實。我們得出結(jié)論,CTB-AuNCs有較強的熒光信號,光穩(wěn)定性好的優(yōu)點,較長的儲存時間和較低的毒性。它是一個簡單、直接、經(jīng)濟的逆行示蹤技術(shù)。AuNCs的熒光發(fā)射光譜為紅色熒光,它是相比我們以前關(guān)于碳納米點研究的主要優(yōu)勢。它可以避免身體組織發(fā)射的藍色自體熒光,并提供更好的對比度和改善信噪比。CTB-AuNCs是一個潛在的逆行熒光納米神經(jīng)示蹤劑,可進一步用于結(jié)合不同的熒光納米顆粒來創(chuàng)建多種顏色的熒光神經(jīng)示蹤劑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R688

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