發(fā)布時(shí)間：2018-04-29 00:02

  本文選題：腸上皮GABA + GABAA受體�。� 參考：《山東大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：第一部分：γ-氨基丁酸能信號(hào)通路在腸上皮表達(dá)及對(duì)小腸液分泌的調(diào)節(jié) 目的 γ-氨基丁酸(γaminobutyric acid,GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一,其在大腦和脊髓分布廣泛,參與突觸后神經(jīng)元的快速抑制效應(yīng)。在生理?xiàng)l件下,GABA由神經(jīng)元內(nèi)谷氨酸脫羧酶(GAD)催化谷氨酸形成。根據(jù)分子量的不同,GAD可分為兩種,分別為：GAD65(65kDa)和GAD67(67kDa).GAD65主要分布在神經(jīng)元軸突末梢內(nèi)的囊泡膜上,參與囊泡釋放的GABA的合成；GAD67則在神經(jīng)元胞體內(nèi)散在分布,其合成的GABA釋放后與突觸外的GABA受體結(jié)合發(fā)揮作用。神經(jīng)元軸突末梢的GABA釋放后快速激活突觸后膜上的GABAA(γ-氨基丁酸A型)受體門控的氯離子通道,引起氯離子向細(xì)胞內(nèi)流動(dòng),使突觸后神經(jīng)元細(xì)胞膜發(fā)生超極化,從而抑制神經(jīng)元的興奮性。GABA、GABA受體及其代謝酶等分子統(tǒng)稱為GABA信號(hào)系統(tǒng)(GABAergic signal system)。除中樞神經(jīng)系統(tǒng)之外,GABA能信號(hào)系統(tǒng)在外周組織也廣泛表達(dá),如肺、肝臟、脾、生殖系統(tǒng)等。GABAA受體作為氯離子通道,在肺上皮細(xì)胞腔面?zhèn)缺磉_(dá),并且被證實(shí)通過氯離子跨膜向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)氣管和支氣管電解質(zhì)和粘液的分泌。氯離子向腸腔內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是腸道液體分泌的原動(dòng)力,腸道內(nèi)氯離子的聚集為水、鈉向腸道轉(zhuǎn)運(yùn)提供滲透壓和電化學(xué)驅(qū)動(dòng)力基礎(chǔ)。有報(bào)道稱GABA能信號(hào)系統(tǒng)在胃癌和結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá),但是其在正常消化道各部分的表達(dá)和生理作用尚不十分清楚。我們推測(cè)GABA能信號(hào)系統(tǒng)可能在腸粘膜上皮表達(dá),并且有可能參與腸道液體分泌。因此本研究的目的是觀察GABA能信號(hào)系統(tǒng)是否在小腸組織表達(dá),尤其是在參與液體分泌的上皮細(xì)胞上的表達(dá)情況；探討GABA能信號(hào)系統(tǒng)在腸粘膜上皮表達(dá)的生理意義。 方法 RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)) 無菌條件下,將IEC-18(a cell line derived from the ileum of rat intestine)細(xì)胞種植于直徑為10cm的圓形培養(yǎng)皿中；待細(xì)胞濃度增殖達(dá)到90%以上時(shí),用4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline, PBS)沖洗細(xì)胞三次,加入Trizol試劑提取細(xì)胞RNA。 健康成年雄性Wistar大鼠脫頸犧牲后,小心取出大腦組織,用4℃預(yù)冷的PBS沖洗3次,剝離出新鮮大腦皮質(zhì),剪碎后,加入Trizol提取組織RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明,提取細(xì)胞和組織的cDNA;然后用GABAA受體各亞單位和GAD65/67的引物通過PCR擴(kuò)增得到相應(yīng)的DNA。再用DNA凝膠電泳觀察各目的帶表達(dá)情況。 免疫組織化學(xué) 石蠟切片染色步驟：將新鮮動(dòng)物組織用4%多聚甲醛(PFA)固定液浸泡24小時(shí)后,將組織脫水并用石蠟包埋后切片(組織厚度：4-5μm),依次進(jìn)行脫蠟、水化和抗原修復(fù)處理。用10%與二抗來源相同的血清室溫條件下封閉切片1小時(shí)后,加入一抗,4℃環(huán)境下孵育過夜。PBS沖洗切片3次,每次5分鐘,加入熒光標(biāo)記的二抗室溫避光孵育1小時(shí)。PBS沖洗3次,每次5分鐘,75%甘油緩沖液封片,熒光顯微鏡觀察拍片。 細(xì)胞免疫染色步驟：將IEC-18細(xì)胞種植在10%多聚賴氨酸(PDL)包被的蓋玻片上,培養(yǎng)48小時(shí),待細(xì)胞貼壁良好后,室溫條件下,用4%多聚甲醛迅速固定10分鐘,PBS沖洗三次,每次5分鐘,其余步驟同石蠟切片染色。 Western Blot 將新鮮組織或細(xì)胞勻漿后,4℃離心(12000g)10分鐘,取離心后的上清液進(jìn)行蛋白定量。用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)下層膠和5%的上層分離膠電泳,濕轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)移至孔徑為0.45微米的PVDF (Polyvinylidene Fluoride)膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1小時(shí),加入一抗覆蓋PVDF膜,4℃孵育過夜。用1倍的TTBS沖洗PVDF膜3次,每次10分鐘。室溫下加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗孵育1小時(shí)。用1倍TTBS沖洗3次,每次10分鐘,ECL顯影。 膜片鉗記錄實(shí)驗(yàn) 將IEC-18細(xì)胞種植在10%多聚賴氨酸包被的蓋玻片上,24小時(shí)后待細(xì)胞貼壁,開始全細(xì)胞記錄。記錄時(shí)用正常細(xì)胞外液(155mM NaC1、1.3mM CaC12,5.4mM KC1、25mM HEPES和33mM葡萄糖(pH7.4,滲透壓315mosmol/kgH2O))常溫循環(huán)灌流細(xì)胞,用700B放大器進(jìn)行記錄。記錄電極內(nèi)液為155mM KC1、15mM KOH、10mM HEPES、2mM MgC12、1mM CaC12、10mM EGTA和2mM Tetraethylammonium(pH7.35,滲透壓315mosmol/kgH20) o電壓鉗記錄時(shí),將細(xì)胞膜電位鉗制在-60mV。信號(hào)采集后用低通濾波器(1-2kH)進(jìn)行濾波處理。 在體小腸液分泌實(shí)驗(yàn) 成年雄性BALB/c小鼠,體重在25-30克之間,實(shí)驗(yàn)前禁食,自由飲水。用2%戊巴比妥鈉(45-50mg/kg)腹腔注射麻醉動(dòng)物,固定四肢和頭部,在恒溫條件下(36℃-38℃)行開腹手術(shù)。在距離盲腸1-2cm處結(jié)扎回腸,沿向心端方向量取2cm回腸進(jìn)行結(jié)扎,使之形成長(zhǎng)約2cm的回腸襻,用直徑為0.33mm的胰島注射器向腸襻內(nèi)注射100μ1的生理鹽水或藥物,確保無滲漏后依次關(guān)閉腹腔各層。待動(dòng)物蘇醒后給予鼠糧和飲水。5小時(shí)后,脫頸犧牲小鼠,取出回腸襻,量取回腸襻的長(zhǎng)度和稱取去除腸液前后的腸襻重量,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 統(tǒng)計(jì)分析 小腸液分泌試驗(yàn)中,用去除腸液前后重量差除以回腸襻的長(zhǎng)度(g/cm)作為觀察指標(biāo),比較對(duì)照組和處理組之間有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示,用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,以P0.05作為顯著性差異界值。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、RT-PCR結(jié)果顯示,小腸上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GABA的合成酶谷氨酸脫羧酶65和67(GAD65/67)以及GABAA受體各亞單位：并且,在大鼠、小鼠的小腸以及小腸上皮細(xì)胞株等組織細(xì)胞表達(dá)GABAA受體β2、ππ亞單位以及GAD65/67蛋白。 2、免疫熒光染色結(jié)果顯示GABA和GAD65/67在小腸上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá),GABAA受體p2/β3和π單位分別在IEC-18細(xì)胞膜和小鼠、胎豬的小腸絨毛上皮細(xì)胞腔面?zhèn)缺磉_(dá)。 3、人的回腸隱窩和絨毛上皮細(xì)胞內(nèi)也表達(dá)谷氨酸脫羧酶65/67和GABAA受體π亞單位。 4、膜片鉗全細(xì)胞記錄顯示,小腸上皮IEC-18細(xì)胞,其膜電位在-37±8mV；在約36%的細(xì)胞上記錄到GABA誘導(dǎo)的內(nèi)向電流,GABAA受體特異性激動(dòng)劑—muscimol可模擬上述反應(yīng)。電流鉗記錄結(jié)果顯示muscimol導(dǎo)致上皮細(xì)胞膜去極化。 5、小鼠回腸襻液體分泌實(shí)驗(yàn)表明,GABA(100μM)和muscimol(10μM)均促進(jìn)小腸液體的分泌，這種促分泌作用不能被TTX(1μM,河豚毒素)阻斷；而GABAA受體特異性阻斷劑--Gabazine (100μM)則明顯降低GABA引起的小腸液分泌量。 結(jié)論 1, GABA能信號(hào)系統(tǒng)在小鼠、大鼠、豬和人的小腸上皮細(xì)胞功能性表達(dá) 2, GABA可通過GABAA受體參與小腸液體分泌。 第二部分：γ-氨基丁酸能信號(hào)通路在腹瀉發(fā)生中的作用及其機(jī)制 目的 腹瀉是臨床上常見的消化系統(tǒng)癥狀,病因和發(fā)病機(jī)制多樣,但大多數(shù)是由于病毒或細(xì)菌毒素侵犯腸道黏膜,破環(huán)腸道結(jié)構(gòu)和腸道上皮細(xì)胞正常的分泌和吸收,導(dǎo)致腸道組織通透性增加和上皮細(xì)胞電解質(zhì)和粘液分泌增多,引起腹瀉。由于小腸上皮細(xì)胞腔面膜上的氯離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是腸道水、鈉、鉀、碳酸氫根等物質(zhì)分泌的原動(dòng)力,很多腹瀉的發(fā)生機(jī)制都離不開腸道上皮細(xì)胞膜上氯離子通道的參與,如CFTR和CaCC兩種氯離子通道與霍亂毒素和旅行者腹瀉的發(fā)生有直接關(guān)系。因此,對(duì)腸上皮細(xì)胞上氯離子通道的研究以及開發(fā)通道特異性的藥物為臨床治療腹瀉提供重要的理論基礎(chǔ)。我們發(fā)現(xiàn)GABA能信號(hào)系統(tǒng)在小腸上皮細(xì)胞表達(dá),外源性GABAA受體激動(dòng)劑引起小腸液的大量分泌。因此我們推測(cè),GABAA受體作為氯離子通道受體,有可能參與腹瀉的發(fā)生過程。本部分我們對(duì)GABA能信號(hào)系統(tǒng)在食物過敏原誘導(dǎo)的腹瀉過程中的作用及其機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)探討。 方法 免疫組織化學(xué)同第一部分 食物致敏原誘導(dǎo)的腹瀉動(dòng)物模型的建立 健康成年雄性BALB/c小鼠(20-25g),隨機(jī)分為對(duì)照組、OVA (50mg, Ovalbumin,卵白蛋白)誘導(dǎo)模型組、OVA誘導(dǎo)和Gabazine (100μM)處理組、OVA誘導(dǎo)和Picrotoxin(100μM)處理組(非特異性GABAA受體阻斷劑)。實(shí)驗(yàn)前禁食,自由飲水。所有動(dòng)物在處理第一天均用硫酸鋁佐劑稀釋的OVA (1mg)腹腔內(nèi)注射,致敏全部小鼠。從第七天開始,對(duì)照組給予生理鹽水250μl灌胃,模型組和處理組給予OVA和相應(yīng)藥物溶于生理鹽水中250μl灌胃,1小時(shí)后觀察并記錄動(dòng)物糞便性狀和排便反應(yīng)。隔天灌胃一次,共灌胃10次后犧牲動(dòng)物,收集動(dòng)物回腸進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和Western blot檢測(cè)。 Western Blot 動(dòng)物組織蛋白獲取和檢測(cè)步驟同第一部分。 IL-13處理后的IEC-18細(xì)胞,預(yù)冷的PBS沖洗3次,用裂解液破碎和收集細(xì)胞,4℃離心,取離心上清液蛋白定量,加入上樣緩沖液后變性蛋白,進(jìn)行SDS-PAGE電泳。濕轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1小時(shí),TTBS沖洗3次,每次10分鐘,加入一抗,4℃環(huán)境下孵育過夜。TTBS沖洗3次,每次10分鐘,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫條件下孵育1小時(shí),TTBS洗3次后,ECL顯影。 統(tǒng)計(jì)分析 動(dòng)物模型指標(biāo)觀察：灌胃后1小時(shí)觀察動(dòng)物糞便稀薄、透明、不成型視為腹瀉模型成功,計(jì)數(shù)每次灌胃后模型成功動(dòng)物的個(gè)數(shù),依次累計(jì),直至犧牲動(dòng)物。以每次灌胃后各組動(dòng)物腹瀉發(fā)生率作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)作圖分析。 結(jié)果 1, OVA誘導(dǎo)的過敏性動(dòng)物腹瀉模型在第7次灌胃時(shí)達(dá)到100%成功；對(duì)照組動(dòng)物無動(dòng)物發(fā)生腹瀉；用Gabazine和Picrotoxin處理的兩組動(dòng)物,明顯降低小鼠腹瀉的發(fā)生率并延緩腹瀉的進(jìn)程。 2,OVA誘導(dǎo)的腹瀉動(dòng)物回腸表達(dá)GAD67和GABAA受體β2/β3、π亞單位比對(duì)照組顯著增高。GABAA受體阻斷劑則降低動(dòng)物腸道β2/β3蛋白的表達(dá),而小腸上皮細(xì)胞和腔面膜上的谷氨酸脫羧酶65/67、π亞單位表達(dá)則增加。 3,IL-13作用4分鐘和4.5分鐘時(shí)最高。而GABAA受體β2/β3亞單位蛋白表 達(dá)量亦在IL-13處理后4分鐘開始增高。 結(jié)論 1,γ-氨基丁酸能信號(hào)系統(tǒng)在過敏性動(dòng)物腹瀉發(fā)病過程中表達(dá)明顯增加,特異性或非特異性阻斷該系統(tǒng)后,動(dòng)物經(jīng)OVA誘導(dǎo)后腹瀉的發(fā)病率明顯降低,且發(fā)病進(jìn)程減緩。 2,Y-氨基丁酸能信號(hào)系統(tǒng)在腹瀉發(fā)病過程中的上調(diào)很可能是由PI3K-AKT-GABAA-R信號(hào)通路介導(dǎo)完成。
[Abstract]:The first part : the expression of gamma - aminobutyric acid signal pathway in the intestinal epithelium and the regulation of the secretion of small intestinal fluid

Purpose

Gamma - aminobutyric acid ( GABA ) is one of the most important inhibitory neurotransmitter in the central nervous system , which is widely distributed in the brain and spinal cord and participates in the rapid inhibitory effect of postsynaptic neurons . Under physiological conditions , GABA is formed by glutamic acid decarboxylase ( GAD ) in neurons . According to the molecular weight , GAD can be divided into two types : GAD65 ( 65kDa ) and GAD67 ( 67kDa ) . GAD65 is mainly distributed on the vesicle membrane in the axon terminal of the neuron , and participates in the synthesis of GABA in the vesicle release ;
GABA receptors and their metabolic enzymes are collectively referred to as the GABAergic signal system . In addition to the central nervous system , the GABA - ergic signal system is widely expressed in peripheral tissues , such as lung , liver , spleen , reproductive system , etc . GABAA receptor is used as chloride ion channel to regulate the secretion of tracheal and bronchial electrolytes and mucus .
To investigate the physiological significance of GABA - ergic signal system in the expression of intestinal mucosal epithelium .

method

RT - PCR ( reverse transcription polymerase chain reaction )

Under sterile conditions , IEC - 18 ( a cell line derived from the ileum of rat intestine ) cells was grown in a circular culture dish with a diameter of 10 cm ;
When the cell concentration was above 90 % , the cells were washed three times with phosphate buffered saline ( PBS ) pre - cooled at 4.degree . C. , and the cell RNA was extracted with Trizol reagent .

Healthy adult male Wistar rats were taken out of the brain tissues , washed three times with PBS pre - cooled at 4 鈩，

本文編號(hào)：1817468