本文選題：組蛋白去乙�；� + 缺血性疾病��； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景：缺血性腦卒中(ischemic cerebral stroke)是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病,具有發(fā)病率高、致殘率高及致死率高的特點(diǎn)。目前普遍認(rèn)為實(shí)現(xiàn)早期缺血部位血流再灌注為救治該類患者的有效手段。但此治療方式存在明顯局限性：一方面可以實(shí)現(xiàn)缺血部位血流再灌,恢復(fù)缺血部位功能,緩解病情；另一方面易引發(fā)腦缺血再灌注損傷(ischemia and reperfusion injury, I/RI),使得病情進(jìn)一步加重。I/RI是指缺血一段時(shí)間的組織經(jīng)過治療重新給予血流供應(yīng)之后,不但未能及時(shí)促進(jìn)缺血部位的功能恢復(fù),反而進(jìn)一步加重?fù)p傷的現(xiàn)象。I/RI可發(fā)生于多種疾病,除缺血性腦卒中外,肝臟缺血、腎臟缺血及心肌梗死等也普遍存在該現(xiàn)象。I/RI發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,且受多種通路調(diào)控。研究表明氧化應(yīng)激、鈣超載、免疫調(diào)節(jié)以及炎癥等均在其中發(fā)揮重要作用。由于調(diào)控機(jī)制復(fù)雜,缺少理想的藥物進(jìn)行干預(yù),使得該類疾病預(yù)后較差。與此同時(shí),表觀遺傳學(xué)在I/RI中發(fā)揮的功能越來越得到大家的重視。表觀遺傳學(xué)(epigenetics)已成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn),其主要涉及DNA甲基化、組蛋白修飾以及包括microRNA在內(nèi)的非編碼RNA對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。常見的組蛋白修飾作用包括乙�；�、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化和羧基化等,其中乙�；揎椬鳛榛蜣D(zhuǎn)錄調(diào)控的重要機(jī)制,主要由組蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶(histone acetylases, HATs)和組蛋白去乙�；�(histone deacetylases, HDACs)共同調(diào)節(jié)；前者可以激活特定基因促進(jìn)轉(zhuǎn)錄過程,后者則通過抑制基因啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的結(jié)合進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)錄。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)及表達(dá)區(qū)域的不同,HDACs分為4個(gè)家族：其中Ⅰ型家族(包括HDAC1,2,3,8).Ⅱ型家族(包括HDAC4,5,6,7,9,10)及Ⅳ型家族(HDAC11)為Zn2+依賴性酶,而Ⅲ類家族Sirtuins (SIRT1-7)為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)依賴性酶。HDACs各亞型在生物體內(nèi)發(fā)揮著各自特異性的生物功能,維持生理活動(dòng)穩(wěn)態(tài)。有報(bào)道證明,HDAC抑制劑(HDAC inhibitors, HDACis)在諸如阿爾茲海默及缺血性腦中風(fēng)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有保護(hù)作用。但是,目前應(yīng)用于市場的HDACis多為非特異性、廣譜性制劑�？紤]到不同HDAC亞型在不同的疾病中發(fā)揮不同作用,廣譜抑制劑的使用會(huì)不可避免導(dǎo)致副作用的發(fā)生。因此,深入研究不同HDAC亞型在缺血性腦卒中的具體作用十分必要。我們前期的研究表明在缺血性腦卒中大鼠模型中,缺血大腦中的HDAC4及HDAC5表達(dá)明顯降低,而HDAC9表達(dá)明顯升高。進(jìn)一步研究表明,HDAC4及HDAC5可通過IMGB1通路保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞。但是HDAC9功能尚不明確,因此闡明HDAC9在缺血性腦卒中的作用,可為設(shè)計(jì)特異性HDACis并應(yīng)用于腦卒中治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù),具有重要的臨床意義。內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂在缺血性疾病中的作用越來越引起人們的重視。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,內(nèi)皮細(xì)胞與其臨近細(xì)胞形成特有的血腦屏障(blood brain barrier, BBB),維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。發(fā)生腦I/RI后,內(nèi)皮細(xì)胞功能明顯受損,體現(xiàn)在炎性浸潤明顯、細(xì)胞凋亡加重、屏障功能降低等多個(gè)方面。研究表明,內(nèi)皮細(xì)胞自噬(autophagy)在腦I/RI中發(fā)揮重要作用,并可能受到表觀遺傳學(xué)調(diào)控。自噬主要通過降解損傷及衰老的細(xì)胞器為細(xì)胞供能發(fā)揮其保護(hù)作用；同時(shí)自噬的過度激活會(huì)導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡(autophagic cell death),加重細(xì)胞損傷。因此,闡明內(nèi)皮細(xì)胞自噬在I/RI中的作用對(duì)于明確腦卒中損傷機(jī)制至關(guān)重要。因此,本實(shí)驗(yàn)主要通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)兩部分,首次闡明了HDAC9在腦I/RI中的表達(dá)變化及作用,并發(fā)現(xiàn)HDAC9可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞自噬調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷。同時(shí),在本課題中我們也通過構(gòu)建大鼠肝臟缺血再灌注損傷,采用另一種常見的缺血性疾病模型研究HDAC9的作用,得到了一致的結(jié)論。研究目的：1、研究大鼠腦缺血再灌注損傷后HDAC9表達(dá)變化及其作用。2、探討HDAC9加重缺氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的機(jī)制。3、闡明HDAC9介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞自噬在缺氧條件下的作用。4、研究大鼠肝臟缺血再灌注損傷后HDAC9表達(dá)變化及其作用。研究方法：第一部分：大鼠腦缺血再灌注損傷后HDAC9表達(dá)變化及其作用1.1 HDAC9在大鼠腦缺血再灌注損傷后的表達(dá)變化1.1.1 Sprague-Dawley大鼠腦缺血再灌注模型建立及評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)大鼠(250-280g)隨機(jī)分組,建立腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型。通過2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-chloride three phenyl tetrazole, TTC)染色、神經(jīng)學(xué)評(píng)分分別評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠癯晒ⅰ?.1.2 HDAC9在腦皮層四種主要細(xì)胞的表達(dá)分布情況通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)及組織免疫熒光染色三個(gè)方面分別檢測(cè)HDAC9在腦皮層四種主要細(xì)胞中的表達(dá)分布情況。1.1.3大腦缺血再灌注損傷后HDAC9于大腦皮層中的表達(dá)變化情況通過實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Real time RT-PCR)及、Vestern Blot檢測(cè)大腦缺血再灌注損傷后HDAC9表達(dá)變化情況。1.2大鼠腦立體定位注射慢病毒方式構(gòu)建HDAC9基因沉默模型1.2.1 HDAC9基因沉默載體構(gòu)建合成HDAC9短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA, shRNA),構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒以用于后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。1.2.2 HDAC9基因沉默大鼠模型構(gòu)建采用大鼠腦立體定位注射慢病毒的方法建立HDAC9基因沉默動(dòng)物模型,通過組織免疫熒光拍照、Western Blot檢測(cè)HDAC9基因沉默效率,評(píng)估實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠窠⒊晒Α?.3 HDAC9基因沉默對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制1.3.1 HDAC9基因沉默對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后的影響HDAC9基因沉默大鼠分組后,行MCAO,模型構(gòu)建成功后,通過大鼠TTC染色、水腫面積分析、神經(jīng)學(xué)評(píng)分反映大鼠腦損傷整體程度,驗(yàn)證HDAC9基因沉默對(duì)于腦缺血再灌注損傷的作用。1.3.2 HDAC9基因沉默對(duì)大鼠血腦屏障損傷的作用1.3.2.1模型構(gòu)建成功后,通過伊文氏藍(lán)染色(evans blue staining)檢測(cè)大腦皮層通透性變化,并通過透射電鏡分析HDAC9基因沉默對(duì)于腦缺血再灌注后內(nèi)皮損傷的作用。1.3.2.2 Western Blot檢測(cè)各分組中大腦皮層組織中緊密連接蛋白(ZO-1, Occludin, Claudin-5)的表達(dá)變化。第二部分：IDAC9在內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用2.1 HDAC9在內(nèi)皮細(xì)胞糖氧剝奪模型(Oxygen and Glucose Deprivation, OGD)中的表達(dá)變化2.1.1培養(yǎng)原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Brain Microvessel Endothelial Cells, BMVECs)。2.1.2 BMVECs經(jīng)OGD處理后HDAC9表達(dá)變化BMVECs行OGD處理,于不同復(fù)氧時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)HDAC9蛋白的表達(dá)變化。2.2 HDAC9基因沉默或過表達(dá)后對(duì)BMVECs在OGD條件下?lián)p傷的作用2.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染構(gòu)建shRNA-HDAC9干擾及pGV230-HDAC9過表達(dá)質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。2.2.2 HDAC9對(duì)OGD處理后BMVECs損傷的影響B(tài)MVECs轉(zhuǎn)染后行OGD處理,檢測(cè)BMVECs功能變化情況。采用Real time RT-PCR方式檢測(cè)BMVECs炎性因子變化,并通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMVECs凋亡變化。闡明HDAC9對(duì)于OGD條件下BMVECs損傷的作用。2.3 HDAC9對(duì)于BMVECs通透性的影響2.3.1體外BMVECs通透性實(shí)驗(yàn)BMVECs種植于特定小室中,shRNA-HDAC9轉(zhuǎn)染后行OGD處理,復(fù)氧24小時(shí)后檢測(cè)BMVECs通透性變化。2.3.2 HDAC9對(duì)于BMVECs緊密連接蛋白的影響B(tài)MVECs行shRNA-HDAC9轉(zhuǎn)染,通過免疫熒光檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1的變化情況,并采用Western Blot處理后的內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白(ZO-1,Occludin,Claudin-5)的變化。第三部分：HDAC9介導(dǎo)的自噬在BMVECs OGD損傷中的作用3.1 HDAC9對(duì)BMVECs自噬的調(diào)控作用分別使用shRNA-HDAC9干擾質(zhì)粒及pGV230-HDAC9過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞。、Vestern Blot檢測(cè)經(jīng)OGD處理后自噬相關(guān)蛋白LC3及p62的變化,Real time RT-PCR檢測(cè)p62 mRNA改變,并通過透射電鏡檢測(cè)HDAC9對(duì)于BMVECs自噬小體數(shù)目的影響。3.2自噬激活對(duì)于BMVECs OGD損傷的影響通過經(jīng)典哺乳類雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin, mTOR)通路的抑制劑-雷帕霉素(Rapamycin)激活自噬。體外內(nèi)皮細(xì)胞通透性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自噬激活后BMVECs通透性變化,同時(shí)通過Real time RT-PCR檢測(cè)BMVECs炎性因子變化,證明自噬在內(nèi)皮細(xì)胞OGD損傷中的作用。第四部分：大鼠肝臟缺血再灌注損傷后HDAC9表達(dá)變化與作用4.1 HDAC9于大鼠肝臟I/RI后的表達(dá)變化4.1.1大鼠肝臟I/R模型建立及評(píng)價(jià)Sprague-Dawley大鼠(250-280g)隨機(jī)分組,建立大鼠I/R模型。通過蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining, HE staining)評(píng)價(jià)模型是否建立成功。4.1.2大鼠肝臟I/RI后HDAC9的表達(dá)變化建模成功后,通過免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry, IHC)及Western Blot檢測(cè)大鼠肝I/RI后HDAC9表達(dá)變化。4.2 HDAC9對(duì)大鼠肝臟I/RI后內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的影響4.2.1大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSECs)培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)采用肝竇內(nèi)皮細(xì)胞RC-RM-0037(上海諾辰生物技術(shù)公司)作為研究對(duì)象。4.2.2 HDAC9在LSECs經(jīng)OGD處理后的表達(dá)變化LSECs行OGD處理,復(fù)氧24小時(shí)后收集細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)HDAC9的表達(dá)變化。4.3 HDAC9基因沉默對(duì)LSECs OGD損傷的影響4.3.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染LSECs使用shRNA-HDAC9轉(zhuǎn)染,Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。4.3.2 HDAC9在LSECs OGD損傷中的作用LSECs轉(zhuǎn)染成功后行OGD處理,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化,證明HDAC9對(duì)于OGD條件下LSECs損傷的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：第一部分：大鼠腦缺血再灌注損傷后HDAC9表達(dá)變化及其作用1.1 HDAC9在大鼠腦I/RI后的表達(dá)變化及作用1.1.1大鼠腦I/R模型建立及評(píng)價(jià)雄性Sprague-Dawley大鼠(250-300g)隨機(jī)分組,通過MCAO建立腦I/R模型。1.1.2 HDAC9在腦皮層中四種主要細(xì)胞的表達(dá)分布情況通過免疫熒光雙標(biāo)法對(duì)大腦皮層組織切片進(jìn)行染色,通過NeuN標(biāo)記神經(jīng)元細(xì)胞、CD34標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞、GFAP標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞及CDl1b標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞,結(jié)果表明HDAC9廣泛表達(dá)于以上四種細(xì)胞中,并在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較低。該結(jié)果進(jìn)一步通過RT-PCR及Western Blot檢測(cè)得以驗(yàn)證。1.1.3大鼠腦I/RI后HDAC9于大腦皮層中的表達(dá)變化情況通過Real time RT-PCR及、Western Blot實(shí)驗(yàn)表明,大鼠腦I/RI后,HDAC9表達(dá)明顯升高并呈時(shí)間依賴性。1.2大鼠腦立體定位注射慢病毒構(gòu)建HDAC9基因沉默模型1.2.1 HDAC9基因沉默載體構(gòu)建為研究HDAC9在大鼠腦I/RI中的作用,我們首先需要建立HDAC9基因沉默大鼠,通過大鼠HDAC9基因測(cè)序,構(gòu)建shRNA-HDAC9慢病毒表達(dá)載體,shRNA-HDAC9序列為ATCATCCTGAGGTCTGTCC。 1.2.2 HDAC9基因沉默大鼠模型構(gòu)建采用大鼠腦皮層立體定位儀注射重組的包備有shRNA-HDAC9的慢病毒載體pGLV3/H1/GFPtPuro (pGLV3)介導(dǎo)大鼠HDAC9基因沉默,通過文獻(xiàn)查閱及實(shí)驗(yàn)自身改進(jìn),確定大鼠注射點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用兩點(diǎn)注射的方法,均注射左側(cè)大腦皮層。第一點(diǎn)位置：前囟前1.0-2.0毫米,中線外側(cè)3.0毫米,注射深度為3.0毫米；第二點(diǎn)位置：前囟后0.5-1.5毫米,中線外側(cè)3.5毫米,注射深度為3.5毫米。通過前期的預(yù)實(shí)驗(yàn),確定轉(zhuǎn)染劑量為每只大鼠9微升慢病毒或者陰性轉(zhuǎn)染病毒。注射速度為每分鐘0.5微升。每次注射完成后留置針頭10分鐘以防止病毒倒流。大鼠慢病毒轉(zhuǎn)染1周后,通過冰凍切片監(jiān)測(cè)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP),發(fā)現(xiàn)GFP廣泛表達(dá)于左側(cè)大腦半球皮層中。為進(jìn)一步研究慢病毒轉(zhuǎn)染的具體細(xì)胞,通過大腦組織冰凍切片免疫熒光的方法,標(biāo)記GFP熒光蛋白并與NeuN標(biāo)記的神經(jīng)元細(xì)胞、CD34標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞、GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞及CDl1b標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行熒光雙標(biāo),結(jié)果表明GFP廣泛表達(dá)于以上四種細(xì)胞。取轉(zhuǎn)染區(qū)域的大腦皮層,與假手術(shù)組及陰性對(duì)照組對(duì)比,Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)慢病毒轉(zhuǎn)染后HDAC9表達(dá)明顯降低。1.3 HDAC9基因沉默對(duì)大鼠腦I/RI的影響及作用機(jī)制1.3.1 HDAC9基因沉默對(duì)大鼠腦I/RI的影響慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠1周后行MCAO模型,于再灌注48小時(shí)后麻醉處死,取材,分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。大鼠腦I/RI后神經(jīng)學(xué)損傷評(píng)分明顯升高,證明模型構(gòu)建成功,而HDAC9基因沉默后評(píng)分較模型組明顯降低。同時(shí)TTC染色表明HDAC9基因沉默后腦梗死區(qū)域明顯降低。以上結(jié)果表明HDAC9升高可加重大腦I/RI損傷。1.3.2 HDAC9基因沉默對(duì)大鼠血腦屏障損傷的作用通過伊文氏藍(lán)染色的方法檢測(cè)血腦屏障,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠腦I/RI后腦組織內(nèi)伊文氏藍(lán)外滲量明顯升高,而HDAC9基因沉默后外滲量明顯降低。內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成血腦屏障的主要細(xì)胞。通過透射電鏡拍照發(fā)現(xiàn)在大鼠I/RI后,內(nèi)皮細(xì)胞腫脹明顯,細(xì)胞核腫脹形態(tài)異常,血腦屏障的整齊性受到破壞,內(nèi)皮細(xì)胞周圍水腫吞噬小泡明顯增多,膜結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重。而HDAC9基因沉默后內(nèi)皮細(xì)胞損傷有所減輕,緊密連接破壞得以恢復(fù)。進(jìn)一步使用Western Blot檢測(cè)表明大鼠I/RI后,緊密連接蛋白(ZO-1, Occludin, Claudin-5)表達(dá)明顯降低,而HDAC9基因沉默后緊密連接蛋白表達(dá)明顯恢復(fù)。以上結(jié)果表明證明HDAC9升高可加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷,破壞血腦屏障。第二部分：HDAC9在內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用2.1內(nèi)皮細(xì)胞糖氧剝奪模型建立該部分實(shí)驗(yàn)使用原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞建立模型。2.2 BMVECs經(jīng)OGD處理后HDAC9表達(dá)變化BMVECs行OGD處理1小時(shí)后,不同復(fù)氧時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞。Western Blot結(jié)果顯示HDAC9于OGD后表達(dá)明顯升高并具有時(shí)間依賴性,選取升高明顯的24小時(shí)為后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)。2.3 HDAC9基因沉默或過表達(dá)后對(duì)BMVECs OGD損傷的影響通過shRNA-HDAC9質(zhì)粒干擾HDAC9, Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率。BMVECs轉(zhuǎn)染成功后行OGD處理,復(fù)氧24小時(shí)后,Real time RT-PCR檢測(cè)炎性因子,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HDAC9基因沉默后,OGD條件下BMVECs炎性因子表達(dá)明顯降低,同時(shí)細(xì)胞凋亡明顯減少。證明HDAC9升高可加重BMVECs OGD損傷。2.4 HDAC9對(duì)于BMVECs細(xì)胞通透性的影響2.4.1體外內(nèi)皮細(xì)胞通透性實(shí)驗(yàn)內(nèi)皮細(xì)胞通透屏障損傷是缺血再灌注損傷的重要方面。內(nèi)皮細(xì)胞通透性分析發(fā)現(xiàn)HDAC9基因沉默后能夠明顯降低BMVECs細(xì)胞透過性。2.4.2 HDAC9對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的影響通過免疫熒光染色ZO-1蛋白發(fā)現(xiàn),HDAC9基因沉默后明顯恢復(fù)BMVECsZO-1表達(dá)。同樣的結(jié)論通過Western Blot檢測(cè)檢測(cè)緊密連接蛋白(ZO-1,Occludin, Claudin-5)得以進(jìn)一步證實(shí)。第三部分：HDAC9介導(dǎo)的細(xì)胞自噬在BMVECs OGD損傷中的作用3.1 HDAC9對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)控作用內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)OGD處理后,于不同復(fù)氧時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞樣本。Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)OGD處理后自噬水平明顯升高,HDAC9基因沉默后LC3-Ⅱ向LC3-I轉(zhuǎn)化進(jìn)一步升高,同時(shí)p62蛋白水平進(jìn)一步降低。Real time RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HDAC9基因沉默對(duì)p62 mRNA水平無明顯影響。BMVECs誘導(dǎo)HDAC9高表達(dá)后,Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HDAC9過表達(dá)后LC3蛋白轉(zhuǎn)化明顯降低,進(jìn)一步通過透射電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HDAC9過表達(dá)后,BMVECs中自噬小體數(shù)目明顯減少。以上結(jié)果均證明HDAC9可以負(fù)調(diào)控BMVECs自噬活性。3.2自噬激活對(duì)于BMVECs OGD損傷的影響Rapamycin激活自噬后,內(nèi)皮細(xì)胞通透性分析發(fā)現(xiàn)Rapamycin處理能夠明顯降低BMVECs細(xì)胞透過性。Real time RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Rapamycin處理可明顯降低BMVECs OGD條件下的炎性因子釋放,減輕炎性反應(yīng)。以上結(jié)果證明細(xì)胞自噬在BMVECs OGD條件發(fā)揮保護(hù)作用。第四部分：HDAC9在大鼠肝臟缺血再灌注損傷后的表達(dá)變化及作用4.1 HDAC9于大鼠肝臟I/RI后的表達(dá)變化4.1.1大鼠肝臟I/R模型建立及評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)大鼠(250-280g)隨機(jī)分組,使用動(dòng)脈夾阻并阻斷尾狀葉及左肝葉的血流,從而造成70%的肝臟缺血,缺血1小時(shí)后松開動(dòng)脈夾實(shí)現(xiàn)血流再灌,建立大鼠肝臟I/R模型。通過HE染色發(fā)現(xiàn),Sham組大鼠肝臟顏色正常,無炎性浸潤,鏡下無異常改變。I/R組鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞腫脹,炎性浸潤及片狀壞死出現(xiàn),表明模型建立成功。4.1.2 HDAC9于大鼠肝臟I/RI后表達(dá)變化通過IHC染色及Western Blot發(fā)現(xiàn),大鼠肝臟I/RI后,肝臟組織內(nèi)]HDAC9表達(dá)明顯升高。4.2 HDAC9對(duì)大鼠肝臟I/RI中內(nèi)皮功能紊亂的影響4.2.1大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)采用肝竇內(nèi)皮細(xì)胞LSECs RC-RM-0037(上海諾辰生物技術(shù)公司)作為研究對(duì)象。4.2.2 HDAC9于LSECs OGD處理后的表達(dá)變化LSECs行OGD處理,復(fù)氧24小時(shí)后收集細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HDAC9蛋白表達(dá)明顯升高。4.3 HDAC9基因沉默對(duì)LSECs OGD損傷的影響4.3.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA-HDAC9轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞,并采用Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。4.3.2 HDAC9對(duì)LSECs OGD損傷的影響LSECs經(jīng)HDAC9轉(zhuǎn)染后行OGD處理,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HDAC9基因沉默可明顯降低內(nèi)皮細(xì)胞OGD條件下的凋亡數(shù)量。結(jié)論與創(chuàng)新性：1、HDAC9于大鼠腦缺血再灌注損傷后表達(dá)明顯升高,HDAC9可明顯加重大鼠腦梗死面積,破壞血腦屏障,從而加重大鼠腦缺血再灌注損傷。2、HDAC9可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞炎性,增加內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)細(xì)胞通透性,加重內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷。3、HDAC9可通過介導(dǎo)自噬來影響內(nèi)皮細(xì)胞功能,自噬升高可明顯降低內(nèi)皮細(xì)胞通透性及炎性反應(yīng),發(fā)揮保護(hù)作用。4、HDAC9于大鼠肝臟缺血再灌注損傷后表達(dá)明顯升高并且HDAC9基因沉默可明顯減輕肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷,提示HDAC9在缺血性組織損傷中起到相同的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R743.3
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本文編號(hào)：1796340