本文選題：膀胱過度活動 + 脛神經(jīng)電刺激　； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：尿液的收集儲存和定期排出依賴于膀胱和尿道的協(xié)調(diào)活動,這一看似簡單的過程卻由一系列極其復(fù)雜的神經(jīng)反射調(diào)控。大腦、腦干、脊髓和周圍神經(jīng)節(jié)通過盆神經(jīng)、腹下神經(jīng)和陰部神經(jīng)構(gòu)成多級調(diào)控系統(tǒng)協(xié)調(diào)下尿路活動。與其它內(nèi)臟器官相比,下尿路的活動有以下特點：(1)其活動完全依賴中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控；(2)因為膀胱只有儲尿和排尿兩種功能狀態(tài),參與調(diào)控的神經(jīng)環(huán)路多為開關(guān)式或位相性；(3)下尿路活動也在高級中樞的隨意控制下進(jìn)行。鑒于下尿路神經(jīng)控制的復(fù)雜性,各種損傷、病變或化學(xué)刺激均可導(dǎo)致下尿路功能障礙,如膀胱過度活動,尿潴留、神經(jīng)源性膀胱或逼尿肌括約肌不協(xié)調(diào)等。而通過干預(yù)特定外周神經(jīng)活動,興奮或阻斷其信號傳導(dǎo),則可能達(dá)到改善下尿路功能障礙的目的。本課題通過以下兩部分內(nèi)容研究調(diào)控外周神經(jīng)活動在下尿路功能障礙治療中的作用及其機(jī)制：(1)μ,1(和δ型阿片類受體在脛神經(jīng)電刺激抑制膀胱過度活動中的作用；(2)不同溫度狀態(tài)對陰部神經(jīng)傳導(dǎo)的影響,并探索安全有效且簡便易行的方法阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)。第一部分μ,K和δ型阿片類受體在脛神經(jīng)電刺激抑制膀胱過度活動中的作用前言：膀胱過度活動癥(0AB)是一種極為常見的臨床癥候群,主要表現(xiàn)為尿急,常伴有尿頻,伴或不伴急迫性尿失禁,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和工作效率。對于OAB的首選治療方式的是行為療法和抗膽堿能藥物治療。但目前治療效果并不理想,再加上藥物多有明顯副作用,患者依從性低,常不能達(dá)到治療要求。神經(jīng)電刺激治療主要通過電流刺激周圍神經(jīng)來影響膀胱活動。目前美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)骶神經(jīng)和脛神經(jīng)電刺激治療OAB,此外有研究表明陰部神經(jīng)電刺激和經(jīng)皮神經(jīng)電刺激也可明顯改善0AB癥狀。目前大量文獻(xiàn)均支持周圍神經(jīng)電刺激可作為一種安全有效且微創(chuàng)的方案用于難治性O(shè)AB的治療。美國泌尿外科學(xué)會指南也推薦TNS和SNM作為頑固性O(shè)AB患者的三線治療方案。然而目前對于神經(jīng)電刺激作用過程中所涉及的神經(jīng)通路和神經(jīng)遞質(zhì)尚不明確。我們課題組的前期研究以短耳貓為實驗對象,通過膀胱內(nèi)灌注低濃度乙酸誘導(dǎo)建立OAB模型,發(fā)現(xiàn)脛神經(jīng)電刺激可明顯抑制OAB癥狀。阿片類受體拮抗劑(Naloxone,1 mg/kg, i.v.)可完全阻斷TNS的作用；而TNS與低劑量阿片類受體激動劑(Tramadol, i.v.)聯(lián)用可明顯提高TNS的作用效果。這些結(jié)果提示阿片類受體在TNS治療OAB過程中起重要作用。阿片類受體在調(diào)節(jié)膀胱收縮方面發(fā)揮重要作用：在脊髓水平,腦啡肽能抑制性神經(jīng)元可抑制膀胱副交感神經(jīng)傳出通路,該效果可被Naloxone阻斷；在脊髓上水平,腦室內(nèi)注射嗎啡或內(nèi)啡肽可抑制膀胱收縮活性；此外,激活腦橋被蓋背側(cè)的阿片類受體也可抑制膀胱反射活動。阿片類受體有三個亞型,分別為μ,κ和δ型阿片類受體。不同亞型的阿片類受體在膀胱活動和TNS中的作用可能不同。深入研究三個亞型在TNS中的作用有助于我們進(jìn)一步理解TNS治療OAB的作用機(jī)制,并為我們開發(fā)新的藥物或聯(lián)合治療提供依據(jù)。目的：研究μ,K和δ型阿片類受體在TNS抑制膀胱過度活動中的作用,深入研究TNS抑制OAB的作用機(jī)制。方法：1.實驗設(shè)計：本實驗共有22只短耳貓參與實驗,根據(jù)實驗需要分為三組,分別給予選擇性μ受體拮抗劑(Cyprodime)、選擇性κ受體拮抗劑(Nor-binaltorphimine)和選擇性δ受體拮抗劑(Naltrindole),評估各個藥物對膀胱活動和脛神經(jīng)電刺激的影響,以研究μ,κ和δ型阿片類受體在膀胱活動和脛神經(jīng)電刺激中的作用。異氟烷麻醉后行氣管插管保持氣道通暢；血氧計固定在舌中部監(jiān)測心率和血氧飽和度；右側(cè)頸動脈置管監(jiān)測動物血壓；左側(cè)上肢頭靜脈置管方便靜脈給藥；結(jié)扎雙側(cè)輸尿管并用橡膠管將尿液引流至體外；于近端尿道向膀胱內(nèi)插入雙腔尿管,導(dǎo)管一側(cè)管腔連接微量灌注泵以向膀胱內(nèi)灌注液體充盈膀胱,另一管腔連接壓力傳感器以行膀胱內(nèi)壓力測定。于踝關(guān)節(jié)上方分離左側(cè)脛神經(jīng),并將三極袖狀電極置入脛神經(jīng)周圍。2.電刺激參數(shù)：根據(jù)前期研究結(jié)果,本實驗中采用單相矩形脈沖電流(5Hz,0.2ms)通過袖狀電極刺激脛神經(jīng)。以開始誘發(fā)貓腳趾運動的最小刺激強(qiáng)度作為刺激強(qiáng)度閾值(T)。實驗過程中采用2T和4T強(qiáng)度刺激脛神經(jīng),來觀察脛神經(jīng)電刺激對OAB的抑制作用及其對不同藥物的反應(yīng)。3.實驗過程：在實驗開始時,首先向膀胱內(nèi)灌注生理鹽水同時行膀胱內(nèi)壓力測定,當(dāng)膀胱出現(xiàn)壓力大于30cmH20且持續(xù)時間長于20秒的收縮時停止灌注,記錄膀胱內(nèi)容量。重復(fù)多次直至膀胱容量穩(wěn)定,即為初始膀胱容量。然后向膀胱內(nèi)灌注0.25%乙酸誘導(dǎo)建立OAB模型,重復(fù)多次直至膀胱容量穩(wěn)定后進(jìn)行脛神經(jīng)電刺激,依次進(jìn)行如下一組CMG檢測：(1)刺激前0.25%乙酸對照,(2)2T-TNS, (3) 4T-TNS,(4)刺激后0.25%乙酸對照,記錄不同狀態(tài)下的膀胱容量。然后根據(jù)實驗分組分別給予不同藥物：第1組動物(n=6)給予累積劑量的Cyprodime (0.003,0.01,0.03,0.1,0.3和1 mg/kg, i.v.);第2組(n=6)給予累積劑量的Nor-binaltorphimine(0.03,0.1,0.3,1.0,3.0和10.0 mg/kg, i. v.);第3組(n=10)給予累積劑量的Naltrindole (0.03,0.1,0.3,1.0,3.0和10.0 mg/kg, i. v.)。每次實驗最后都給予非選擇性的阿片類受體拮抗劑Naloxone (1mg/kg, i.v.)。每次給藥后等待10分鐘,然后依次進(jìn)行一組CMG檢測(1)刺激前0.25%乙酸對照,(2)2T-TNS, (3) 4T-TNS,(4)刺激后0.25%乙酸對照。4.數(shù)據(jù)處理：同一動物每次通過CMG測得的膀胱容量均與初始膀胱容量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,記錄為初始膀胱容量百分比。標(biāo)準(zhǔn)化后可實現(xiàn)不同動物之間數(shù)據(jù)相互比較,不同動物的統(tǒng)計數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。采用Two-way ANOVA分析脛神經(jīng)電刺激對OAB的抑制作用,One-way ANOVA分析累積劑量的藥物的效果。所有統(tǒng)計分析均在GraphPad Prism4.0統(tǒng)計軟件中進(jìn)行,P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：1.脛神經(jīng)電刺激明顯抑制膀胱過度活動膀胱內(nèi)灌注0.25%7,酸后膀胱容量明顯降低至初始膀胱容量的21.15±12.21%(P0.01),提示成功誘導(dǎo)OAB模型。2T或4T脛神經(jīng)電刺激可明顯抑制OAB,明顯增加膀胱容量至正常狀態(tài)的52.92±16.76%和57.39±21.62%(P0.01)。TNS刺激后膀胱容量與刺激前無明顯差異,提示沒有刺激后遺效應(yīng)存在。2.選擇性阻斷μ,K或δ型阿片類受體對膀胱活動和脛神經(jīng)電刺激的影響Cyprodime (μ受體拮抗劑)對乙酸對照的膀胱容量沒有明顯影響,但從0.1mg/kg劑量開始明顯降低TNS的抑制作用(P0.05),在0.3-1 mg/kg劑量時完全消除了TNS的抑制作用。Nor-binaltorphimine(κ受體拮抗劑)從lmg/kg劑量開始明顯降低TNS的抑制作用(P0.05),在3-10 mg/kg劑量時完全消除TNS的抑制作用；但與Cyprodime不同的是nor-binaltorphimine (1-10 mg/kg)明顯增加乙酸對照狀態(tài)下的膀胱容量(P0.05)。Naltrindole(δ受體拮抗劑)明顯增加乙酸對照狀態(tài)下的膀胱容量(P0.05)并明顯降低TNS的抑制作用(P0.05),但即使在最大劑量時它也不能完全消除TNS的抑制作用。3.Naloxone的作用Cyprodime處理后,Naloxone(lmg/kg)對乙酸對照和TNS狀態(tài)下的膀胱容量均無明顯影響；Nor-b i nalt orph i mi ne處理后,Naloxone(lmg/kg)明顯降低乙酸對照和TNS狀態(tài)下的膀胱容量,逆轉(zhuǎn)Nor-binaltorphimine引起的膀胱容量的增加；Naltrindole處理后,Naloxone(lmg/kg)對乙酸對照狀態(tài)下的膀胱容量無明顯影響,但可消除殘留的TNS的抑制作用。結(jié)論：μ和κ型阿片類受體在在脛神經(jīng)電刺激抑制OAB過程中發(fā)揮主要作用,而δ型阿片類受體只發(fā)揮微弱的作用。此外,κ和δ型阿片類受體也參與了膀胱過度活動的發(fā)生。第二部分不同溫度狀態(tài)對陰部神經(jīng)傳導(dǎo)的影響前言：正常狀態(tài)下,在儲尿期膀胱逼尿肌松弛而尿道括約肌收縮有利于膀胱儲存尿液,排尿期膀胱逼尿肌收縮而尿道括約肌舒張有利于尿液排出,膀胱逼尿肌和尿道括約肌協(xié)調(diào)配合完成整個排尿過程。在某些病理狀態(tài)下(如脊髓損傷),膀胱和尿道間的協(xié)調(diào)性消失,在排尿期膀胱逼尿肌和尿道括約肌同時收縮,稱為逼尿肌-括約肌失調(diào)(DSD)。DSD引起膀胱內(nèi)高壓、排尿困難,長期還導(dǎo)致輸尿管反流和腎衰竭,膀胱內(nèi)大量殘余尿和頻發(fā)導(dǎo)尿也容易引起膀胱內(nèi)感染和炎癥發(fā)生。目前針對DSD的治療主要是間歇性導(dǎo)尿、經(jīng)尿道括約肌切開術(shù)和括約肌內(nèi)肉毒素A注射,但容易導(dǎo)致永久性尿失禁。局部應(yīng)用苯酚溶液阻斷陰部神經(jīng)傳導(dǎo)也能起到治療作用。如果可以在排尿時可逆性的阻斷陰部神經(jīng)傳導(dǎo)并在排尿完畢后恢復(fù)陰部神經(jīng)傳導(dǎo),即可達(dá)到既有效改善排尿又避免永久性尿失禁的目的。神經(jīng)傳導(dǎo)阻斷在基礎(chǔ)研究和臨床治療中均有廣泛的應(yīng)用,目前有許多方法均可阻斷神經(jīng)傳導(dǎo),歸納起來主要為以下四類：化學(xué)藥物阻斷、手術(shù)阻斷、電刺激阻斷和溫度刺激阻斷�；瘜W(xué)藥物阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)主要包括應(yīng)用變性藥物引起不可逆性軸突損傷從而永久性阻斷神經(jīng)傳導(dǎo),或者應(yīng)用某種受體拮抗劑可逆性阻斷突觸傳導(dǎo)從而引起可逆性神經(jīng)阻滯。臨床上已經(jīng)廣泛應(yīng)用局部注射麻醉藥物誘導(dǎo)可逆的神經(jīng)阻滯,但由于難以實現(xiàn)針對神經(jīng)的慢性長期給藥,藥物阻滯多用于一過性神經(jīng)阻滯。手術(shù)阻斷主要是切斷神經(jīng)來不可逆的阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)。電刺激包括應(yīng)用直流或中頻電流刺激阻斷突觸傳導(dǎo)或應(yīng)用高頻電流刺激產(chǎn)生局部神經(jīng)傳導(dǎo)障礙。目前臨床上有報道應(yīng)用植入性的高頻電流刺激器實現(xiàn)慢性阻斷迷走神經(jīng)來治療肥胖癥或阻斷脊髓神經(jīng)根來治療疼痛。但高頻刺激在實現(xiàn)神經(jīng)傳導(dǎo)阻滯前總會產(chǎn)生一次初始神經(jīng)發(fā)放,可引起神經(jīng)支配器官的強(qiáng)烈反應(yīng)或明顯痛覺,這也限制了該技術(shù)的臨床應(yīng)用。早在上世紀(jì)初,就有學(xué)者提出可通過改變神經(jīng)局部溫度實現(xiàn)神經(jīng)傳導(dǎo)阻滯。在槍烏賊、牛蛙和貓的體內(nèi)實驗表明,局部46。C以上的高溫可阻斷神經(jīng)傳導(dǎo),且溫度越高,誘導(dǎo)阻斷所需時間越短。但高溫阻斷的結(jié)果難以控制,容易出現(xiàn)過度加熱造成神經(jīng)不可逆性神經(jīng)損傷。低溫刺激(6。C)也可阻斷狗陰部神經(jīng)的傳導(dǎo),而且是可逆性的阻斷。但目前將生物體內(nèi)局部神經(jīng)溫度降至如此低的溫度較為困難,需要消耗大量能量,而且長期應(yīng)用可能損傷周圍組織。因此我們需要尋找一種安全有效且簡便易行的方法誘導(dǎo)神經(jīng)傳導(dǎo)阻滯,從而用于各種神經(jīng)反射亢進(jìn)疾病的治療。目的：評估不同溫度刺激對陰部神經(jīng)傳導(dǎo)的影響,并探索安全有效且簡便易行的方法誘導(dǎo)神經(jīng)傳導(dǎo)阻滯。方法：1實驗設(shè)計異氟烷麻醉后,行氣管插管保持氣道通暢；血氧計固定在舌中部監(jiān)測心率和血氧飽和度；右側(cè)頸動脈置管監(jiān)測動物血壓；左側(cè)上肢頭靜脈置管方便靜脈補(bǔ)充液體；結(jié)扎雙側(cè)輸尿管并用橡膠管引流尿液至體外；于近端尿道向尿道內(nèi)插入雙腔導(dǎo)管,一側(cè)管腔連接微量灌注泵以向尿道內(nèi)灌注生理鹽水,另一管腔連接壓力傳感器測定尿道內(nèi)壓力變化。在尾根部和坐骨切跡之間游離雙側(cè)陰部神經(jīng)并切斷中樞端,兩側(cè)陰部神經(jīng)分別進(jìn)行實驗。將陰部神經(jīng)游離端穿過由細(xì)銅管(內(nèi)徑0.36毫米,外徑1.57毫米)繞成的銅管圈(長度9毫米,內(nèi)徑2毫米),同時測溫探頭置于銅管圈內(nèi)壁與神經(jīng)之間測定局部溫度,銅管圈內(nèi)壁測溫探頭和神經(jīng)表面接觸但又不會對神經(jīng)產(chǎn)生壓迫,通過調(diào)節(jié)銅管中循環(huán)水的溫度來調(diào)節(jié)局部神經(jīng)溫度。神經(jīng)游離端連接鉤狀電極以間歇性電流(刺激5秒/間隔20秒)刺激陰部神經(jīng),正常狀態(tài)下電刺激通過陰部神經(jīng)支配尿道括約肌間歇性收縮,表現(xiàn)為間歇性的尿道內(nèi)壓力升高；如果溫度變化阻斷神經(jīng)傳導(dǎo),則電刺激時尿道括約肌無反應(yīng),尿道內(nèi)壓力無明顯變化。最后陰部神經(jīng)周圍皮瓣通過絲線拉起形成小的器官池,其中充滿35-37。C的生理鹽水以維持恒溫環(huán)境。2.實驗過程本實驗共涉及13只短耳貓中的21條陰部神經(jīng)神經(jīng),依次進(jìn)行如下實驗：2.1將局部神經(jīng)溫度依次降低至25、20、15、10、5和20c,每次持續(xù)50-60秒,分別觀察各個溫度狀態(tài)對神經(jīng)傳導(dǎo)的影響,首次出現(xiàn)完全性神經(jīng)傳阻滯時的溫度即為低溫阻斷閾值；2.2將局部神經(jīng)溫度依次升高至42、44、46、48、50、52和54℃,每次持續(xù)50-60秒,分別觀察各個溫度狀態(tài)對神經(jīng)傳導(dǎo)的影響,當(dāng)出現(xiàn)完全性神經(jīng)傳阻滯時停止繼續(xù)升溫,此時的溫度即為高溫阻斷閾值；2.3步驟2中神經(jīng)經(jīng)過高溫神經(jīng)阻斷后,重復(fù)步驟1,觀察高溫阻斷后低溫阻斷閾值有無變化,若有變化則重復(fù)檢測低溫阻斷閾值,直至其恢復(fù)到加熱前的狀態(tài),記錄該變化的持續(xù)時間；2.4因長時間加熱容易引起不可逆性神經(jīng)阻斷,我們還檢測不同時間(0.6-3.8分鐘)的閾值溫度加熱后,神經(jīng)傳導(dǎo)的恢復(fù)情況,記錄引起不可逆性神經(jīng)阻斷需要的加熱時間；2.5首先檢測初始低溫神經(jīng)阻斷閾值,然后升高溫度至尚未引起阻斷的程度(46-48。C),持續(xù)5分鐘,然后重復(fù)檢測低溫阻斷閾值有無變化,重復(fù)加熱3次記錄其對低溫阻斷閾值的影響。3數(shù)據(jù)處理：實驗中對陰部神經(jīng)進(jìn)行間歇性電刺激,通過檢測尿道內(nèi)壓力變化來反映陰部神經(jīng)的傳導(dǎo)情況。將高溫或低溫刺激時尿道壓力幅值標(biāo)準(zhǔn)化為溫度變化前尿道壓力幅值的百分比,以此來代表高溫或低溫刺激對神經(jīng)傳導(dǎo)的影響。不同動物的統(tǒng)計數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示,采用t檢驗、One-way ANOVA和Two-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,應(yīng)用GraphPad Prism4.0統(tǒng)計軟件完成統(tǒng)計分析,P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：間歇性(刺激5秒,間隔20秒)的陰部神經(jīng)電刺激(50 Hz,0.2 ms,1-10 V)可誘導(dǎo)尿道括約肌間歇性收縮,從而引起尿道內(nèi)超過40cmH2O的壓力變化。手動向銅管內(nèi)推注冷水/熱水可快速降低/升高并維持局部溫度,波動在±1℃之間,停止推注后局部溫度迅速回復(fù)至正常狀態(tài)。1.降低局部溫度時,20℃及以上溫度刺激對神經(jīng)傳導(dǎo)無明顯影響,15℃開始出現(xiàn)神經(jīng)阻斷。20條神經(jīng)中,2條神經(jīng)在15°℃被完全阻斷,4條在10℃時被完全阻斷,11條在50℃時被完全阻斷,另外3條在2°℃被完全阻斷,平均阻斷溫度為6.55±3.83℃。無論是短時間(50-60秒)還是長時間(4-10分鐘)低溫刺激均不會引起不可逆性神經(jīng)損傷。2.升高局部溫度時,48℃及以下溫度刺激對神經(jīng)傳導(dǎo)無明顯影響,50℃開始出現(xiàn)神經(jīng)阻斷。檢測的14條神經(jīng)中,2條神經(jīng)在50°被完全阻斷,6條在52℃時被完全阻斷,6條在54℃時被完全阻斷,平均阻斷溫度為52.57±1.45℃。局部溫度恢復(fù)正常后狀態(tài)后,短時間的神經(jīng)阻斷(1.27±0.44分鐘以內(nèi))可完全恢復(fù)神經(jīng)傳導(dǎo),而長時間神經(jīng)阻斷(2.74±0.54分鐘以上)則引起不可逆性神經(jīng)損傷。3.短時間阻斷性高溫刺激對后續(xù)低溫阻斷閾值的影響：部分陰部神經(jīng)(n=12)依次接收低溫阻斷、高溫阻斷然后再次低溫阻斷。經(jīng)過短時間阻斷性高溫刺激后,陰部神經(jīng)對低溫刺激的反應(yīng)曲線明顯右移,即陰部神經(jīng)對低溫刺激的敏感性明顯增加。高溫刺激前需要平均7.17±1.36℃(2-15℃)的低溫刺激才能阻斷陰部神經(jīng)傳導(dǎo)；而經(jīng)過阻斷性高溫刺激后,平均17.92±1.30℃(10-25℃)的低溫刺激即可阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)。這種影響隨時間逐漸消退,即升高的低溫阻斷溫度逐漸降低,最終恢復(fù)到初始的水平,這個過程持續(xù)42.84±7.00分鐘。4.長時間非阻斷性局部高溫(46-48℃)對后續(xù)低溫阻斷閾值的影響：非阻斷性局部高溫(46-48℃)也可明顯升高后續(xù)低溫阻斷溫度,但需要較長時間的加熱過程。5分鐘的局部高溫過程對神經(jīng)傳導(dǎo)沒有明顯影響,但可明顯升高低溫阻斷溫度(6.43±2.44℃vs10.0±2.89℃),重復(fù)加熱有累積效果,3次重復(fù)加熱可明顯升高低溫阻斷溫度至14.29±4.50℃。結(jié)論：本實驗證實了局部高溫或低溫刺激均可誘導(dǎo)陰部神經(jīng)傳導(dǎo)阻滯,并首次發(fā)現(xiàn)局部高溫可明顯提高低溫阻斷所需的溫度。這一發(fā)現(xiàn)提供了一種安全有效且方便實現(xiàn)的阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)的方法,即通過局部高溫處理后實現(xiàn)室溫(10-25。C)下阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R691.5
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本文編號：1783429