發(fā)布時間：2018-04-14 12:21

  本文選題：動脈粥樣硬化 + 內(nèi)臟脂肪素��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2014年碩士論文

【摘要】：研究背景 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease, CAD)的主要病理基礎。也是心血管系統(tǒng)疾病中最常見的疾病,嚴重危害人類健康,而AS的發(fā)病機制至今尚未明確。隨著動脈粥樣硬化研究的不斷深入,人們逐漸認識到炎癥反應是AS發(fā)生、發(fā)展過程的的病理基礎�？寡字委熓欠乐蜛S相關疾病的重要策略之一。 內(nèi)臟脂肪素(visfatin)是新發(fā)現(xiàn)的一種脂肪細胞因子,已有研究visfatin通過促炎癥反應在AS的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。臨床研究顯示,冠心病患者血漿的visfatin的升高伴有白介素-6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-a)等炎癥介質(zhì)的升高。且研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者的血漿visfatin水平與血管內(nèi)皮細胞功能成顯著負相關,而眾所周知血管內(nèi)皮損傷是AS發(fā)生的始動環(huán)節(jié)之一,從起始環(huán)節(jié)干預AS的形成,保護血管內(nèi)皮免受各種炎癥因子的作用,是抗AS發(fā)生的關鍵。 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是一類存在于真核細胞中的絲/蘇氨酸蛋白激酶。MAPK包括了3種主要的亞家族：SAPK/JNK(stress-activated protein kinases/c-Jun NH2-terminal kinases)、 ERKl/2(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)和p38分裂原激活蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)。其中P38MAPK和JNK通路主要對炎性細胞因子和多種類型的細胞應激信號進行傳導,與細胞分化、細胞凋亡、應激反應密切相關。且已有研究已表明P38MAPK、JNK通路均參與了AS的病理過程。本研究旨在探討Visfatin是否受P38MAPK、JNK信號分子的調(diào)節(jié)誘導HUVEC損傷從而參與AS炎癥反應。 定心方(Dingxin Recipe, DXR)由丹參、三七、赤芍、瓜萎、茯苓、黨參、靈芝、酸棗仁、苦參、黃連等組成,具有益氣活血祛痰燥濕之功效,臨床研究證明其對冠心病有良好的療效,其對缺血及再灌注過程的炎癥激活有顯著的抑制作用同時降低缺血再灌注損傷大鼠JNK和P38MAPK蛋白的表達,增強ERK蛋白的表達來。本論文要探討定心方是否受P38MAPK和JNK信號通路調(diào)控發(fā)揮保護由visfatin誘導損傷的HUVEC,從而起到抗AS的作用。 第一章visfatin對HUVEC增殖抑制及定心方含藥血清的干預 目的： 不同濃度及時間visfatin對HUVEC增殖影響 不同濃度及時間DXR含藥血清對HUVEC增殖影響 DXR含藥血清對visfatin抑制的HUVEC的增殖影響 方法及分組： 定心方含藥血清的制備：60只雄性SD大鼠,體重200-250g,隨機分為2組,每組30只,分別灌服定心方水煎劑和等體積生理鹽水。定心方給藥劑量為18.59g/kg/d,每日藥量分兩次灌胃,連續(xù)7d。末次給藥前,禁食不禁水12h,末次給藥2h后行10%水合氯醛(4ml/kg)麻醉,腹主動脈采血。血標本4℃靜置4h,3500r/min離心10min,分離血清,0.22μ.m微孔濾膜過濾除菌,56℃滅活30mmin,每只大鼠血清單獨分裝,-80℃保存?zhèn)溆谩?Visfatin濃度組：分別用0、50、100、200μg/Lvisfatin處理HUVEC24h。 Visfatin時間組：以100μg/L visfatin分別處理HUVEC0、6、12、24、48h。 DXR含藥血清濃度組：將提出的含藥血清分別稀釋為0、0.25%、0.5%、1%、2%、5%、10%、20%DXR含藥血清加入HUVEC作用24h。 DXR含藥血清時間組：用0.5%DXR含藥血清分別作用0、6、12、24、48h。 DXR含藥血清及相關的通路抑制劑預處理細胞分組：P38MAPK通路分組：①正常對照組；②Visfatin+SB203580:SB203580(終濃度為10μmol/L)預孵育細胞30min,加入終濃度為100μg/L Visfatin刺激24h；③Visfatin+DXR藥物血清組：加入5%DXR藥物血清預孵育1h,加入終濃度為100μg/L Visfatin刺激24h；④Visfatin組：加入終濃度為100μg/L Visfatin刺激24h；⑤Visfatin+空白血清組：加入5%空白血清預孵育1h,加入終濃度為100μg/L Visfatin刺激24h。 JNK通路分組：①對照組；②visfatin+DXR藥物血清組：加入5%DXR藥物血清預孵育1h,加入終濃度為100μg/L的Visfatin刺激24h；③Visfatin+空白血清組：加入5%空白血清預孵育1h,加入終濃度為100μg/L的Visfatin刺激24h；④visfatin組：加入visfatin100μg/L刺激24h；⑤visfatin+SP600125組：加入SP600125(終濃度為10μmol/L)預處理細胞30min,再給予visfatin100μg/L刺激24h。 MTT比色法測定HUVEC的增殖：將HUVEC接種于九十六孔板,按實驗分組給予相應的處理因素后,每組設6個復孔。按MTT法具體操作步驟進行操作,在酶標儀490nm處測其OD值。 結(jié)果： 1.不同濃度及時間的Visfatin對HUVEC增殖的影響 與對照組比,50μg/Lvisfatin作用24h對HUVEC增殖無顯著抑制作用,100、200μg/L visfatin作用24h抑制]HUVEC增殖具有顯著性(P0.01)經(jīng)統(tǒng)計學處理兩組間差異無顯著性；100μg/L visfatin作用6、12h無明顯抑制HUVEC增殖,作用24、48h均能顯著抑制HUVEC增殖(P0.05或P0.01),經(jīng)統(tǒng)計學處理兩組間差異無顯著性。 2.不同濃度及時間DXR含藥血清對HUVEC的增殖影響 與對照組比,0、0.25%、0.5%、1%、2%DXR含藥血清作用24h對HUVEC的增殖無顯著性影響；5%、10%、20%DXR含藥血清作用24h均能顯著性的增強細胞的增殖(P0.01),經(jīng)統(tǒng)計學處理組間差異無顯著性。與對照組比,5%DXR含藥血清作用6、12h對HUVEC的增殖無顯著性影響；5%DXR含藥血清作用24、48h均能顯著性的增強細胞的增殖(P0.01),經(jīng)統(tǒng)計學處理組間差異無顯著性。 3.DXR含藥血清及SB203580、SP600125對visfatin損傷的HUVEC增殖影響 與對照組比,visfatin與空白大鼠血清作用24h均可以顯著性的抑制HUVEC的增殖(P0.01)；與visfatin組比,5%DXR含藥血清、SB203580、SP600125作用24h可以增強由visfatin損傷的HUVEC增殖(P0.01)。 結(jié)論： visfatin能顯著抑制HUVEC的增殖,DXR含藥血清、p38MAPK通路抑制劑SB203580、JNK通路抑制劑SP600125可以增強由visfatin誘導抑制HUVEC的增殖。說明visfatin有可能受p38MAPK、JNK信號通路調(diào)節(jié)抑制HUVEC增殖。而DXR含藥血清也有可能通過調(diào)節(jié)它們來保護HUVEC。 第二章visfatin誘導的HUVEC分泌IL-6和TNF-α及定心方含藥血清的干預 目的： 不同濃度及時間Visfatin誘導HUVEC分泌IL-6和TNF-α的影響 DXR含藥血清對Visfatin誘導的HUVECIL-6和TNF-α的含量影響 方法及分組： visfatin時間梯度與濃度梯度分組同第一章。 DXR含藥血清及相關的通路抑制劑預處理細胞分組同第一章。 將HUVEC以1×105/mL的密度接種于培養(yǎng)皿,按不同實驗目的進行分組處理,處理完畢后,收集細胞上清,分別按照IL-6和TNF-α試劑盒說明書進行操作,在酶標儀450nm波長處測量每組OD值。實驗重復三次以上。 結(jié)果： 1.不同時間及濃度Visfatin對HUVEC上清液中的IL-6和TNF-α含量的影響 與對照組比,50μg/Lvisfatin作用24h對HUVEC上清液中的IL-6和TNF-a水平無明顯增高,100、200μg/Lvisfatin作用24h增高IL-6和TNF-α水平具有顯著性(P0.01),經(jīng)統(tǒng)計學處理兩組間差異無顯著性；與對照組相比,100gg/L的visfatin作用6、12h對HUVEC上清液中的IL-6和TNF-α水平無明顯增高,作用24、48h均能誘導其表達增高(P0.05或P0.01),經(jīng)統(tǒng)計學處理兩組間差異無顯著性。 2.DXR含藥血清、SB203580、SP600125對HUVEC上清液中的IL-6和TNF-a含量的影響 與對照組比,visfatin組和visfatin+空白血清組HUVEC培養(yǎng)上清IL-6和TNF-a表達顯著增高(P0.01)；與visfatin組比,DXR藥物血清、SB203580、SP600125均可顯著性的抑制由visfatin誘導的IL-6和TNF-a表達(P0.05或P0.01)。 結(jié)論： visfatin能誘導HUVEC分泌IL-6和TNF-a增加,從而損傷HUVEC功能,DXR含藥血清、SB203580、SP600125可以抑制visfatin誘導的HUVEC對IL-6和TNF-a的分泌,保護HUVEC功能。機制有可能與激活了P38MAPK及JNK通路有關。 第三章P38MAPK及JNK通路在visfatin誘導HUVEC細胞損傷的作用及定心方含藥血清的干預 目的： 結(jié)合前兩章,研究visfatin的促炎癥反應作用及其機制是否受P38MAPK及JNK信號通路的調(diào)節(jié)。 結(jié)合前兩章,研究定心方是否通過P38MAPK及JNK信號通路來減弱visfatin促炎癥反應過程。 方法及分組： visfatin時間梯度與濃度梯度分組同第一章。 DXR含藥血清及相關的通路抑制劑預處理細胞分組同第一章。 Western blot法檢測p38MAPK及JNK通路蛋白的表達,HUVEC按實驗分組處理完成后,以Western及IP細胞裂解液提取HUVEC蛋白,BCA法進行蛋白定量,進行蛋白印跡實驗。以β-actin為內(nèi)參,將處理好的蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE分離,電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,封閉后,孵育一抗和二抗,ECL顯色,KODAK Image Station2000MM成像系統(tǒng)采集圖像,獲得圖像用圖像處理軟件Image Tool3.0測定并分析條帶灰度值。 結(jié)果： 1.不同濃度及時間visfatin對HUVEC中p-p38MAPK、p-JNK及總p38MAPK、總JNK蛋白表達的影響 與對照組相比,50μg/L visfatin作用24h對HUVEC中p-JNK的表達無明顯升高,100、200visfatin作用24h能顯著增高HUVEC中p-p38MAPK、p-JNK的表達(P0.05或P0.01),經(jīng)統(tǒng)計學處理兩組間無顯著性差異：100gg/L的visfatin于6、12h HUVEC中的p-p38MAPK、p-JNK的表達無明顯升高,而在24、48h均可顯著增高p-p38MAPK、p-JNK的表達(氏0.01),經(jīng)統(tǒng)計學檢查兩組間無顯著性差異。 2.DXR含藥血清、SB203580、SP600125.對HUVEC中p-p38MAPK、p-JNK及總p38MAPK、總JNK蛋白表達的影響 與對照組相比,visfatin組和visfatin+空白血清組的細胞p-p38MAPK、p-JNK蛋白表達能顯著性可升高(P0.05)；與visfatin組比,DXR含藥血清和SB203580、SP600125能顯著性的抑制visfatin誘導的p-p38MAPK、p-JNK表達(P0.01)。 結(jié)論： 結(jié)合前兩章結(jié)論可知,visfatin可抑制HUVEC的增殖并誘導HUVEC分泌IL-6和TNF-a增加,其機制與促進p38MAPK及JNK磷酸化有關。DXR含藥血清通過受p38MAPK及JNK通路調(diào)節(jié)減少visfatin誘導的]HUVEC分泌IL-6和TNF-α,保護visfatin誘導的HUVEC的損傷。 全文總結(jié)： visfatin促炎作用機制與促進HUVEC中JNK、P38MAPK的磷酸化有關,DXR含藥血清通過調(diào)節(jié)p38MAPK及JNK通路保護visfatin誘導的HUVEC的損傷。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R541.4

【參考文獻】

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本文編號：1749294