本文選題：豬流感　切入點(diǎn)：乳酸菌　出處：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：豬流感(Swine influenza,SI)是全球范圍內(nèi)廣為流行的動物傳染病之一,近幾年來在我國各地發(fā)病較為常見,給我國的養(yǎng)殖業(yè)造成了十分重大的經(jīng)濟(jì)損失。研究表明乳酸菌能特異性表達(dá)外源目的蛋白,是一種極具應(yīng)用潛力的多功能型微生態(tài)制劑。其特有的安全性、低成本和易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)也昭示著它作為基因工程疫苗表達(dá)載體所具有的重要研究價值。本試驗(yàn)選用乳酸菌作為外源蛋白的遞送載體,將豬流感病毒(Swine influenza virus,SIV)主要保護(hù)性抗原M2e蛋白基因與小鼠的IgG的Fc受體片段基因融合在一起,將外源基因的特異性免疫及乳酸菌的益生功能集合于一身,研制Fc融合M2e基因的重組乳酸菌口服疫苗并對其免疫效果進(jìn)行初步檢測及分析。研究內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)重組乳酸菌的構(gòu)建、表達(dá)及免疫原性分析實(shí)驗(yàn)方法:通過合成、酶切、回收等方法制備包含融合基因的四組重組質(zhì)粒,分別為質(zhì)粒pSIP409、質(zhì)粒pSIP409-3M2e、質(zhì)粒pSIP409-3M2e-Fc(Fc未突變)、質(zhì)粒pSIP409-3M2e-Fc(Fc已突變)。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)中大量復(fù)制,采用雙酶切等方法進(jìn)行鑒定,運(yùn)用電轉(zhuǎn)化技術(shù)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物乳桿菌中并經(jīng)誘導(dǎo)肽(SppIP)誘導(dǎo)獲得表達(dá),利用SDS-PAGE、Western blotting進(jìn)一步檢測外源目的基因在乳酸菌中的表達(dá),結(jié)果顯示重組蛋白pSIP409-3M2e、pSIP409-3M2e-Fc(Fc未突變)和pSIP409-3M2e-Fc(Fc已突變),以及所表達(dá)的蛋白均具有反應(yīng)原性,為構(gòu)建SIV重組乳酸菌口服制劑奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:通過上述方法成功制備重組乳酸菌,經(jīng)酶切檢驗(yàn)結(jié)果完全正確,且重組乳酸菌所表達(dá)的蛋白均具有反應(yīng)原性,為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。(2)重組乳酸菌pSIP409-3M2e-Fc免疫保護(hù)效果的檢測實(shí)驗(yàn)方法:將已成功制備的四組重組乳酸菌復(fù)蘇,并加入誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)蛋白的表達(dá),隨后利用小鼠灌胃器通過灌胃的方式對小鼠進(jìn)行初次免疫和加強(qiáng)免疫。初次免疫時間為第1天、第3天、第5天,加強(qiáng)免疫時間為第26天、28天、第30天。加強(qiáng)免疫后一周左右通過流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠腸系膜淋巴結(jié)和潘氏小結(jié)中CD95+PNA+的數(shù)量變化情況以及腸系膜淋巴結(jié)和潘氏小結(jié)中B220+IgA+的數(shù)量變化情況,這些指標(biāo)指示著B細(xì)胞的活化情況,從而可以通過這些指標(biāo)的變化來鑒定重組乳酸菌對小鼠的免疫效果。并利用ELISA試劑盒檢測各組小鼠血液中IL-4和IFN-γ的分泌情況。初次免疫和加強(qiáng)免疫后一周分別收取各組小鼠的糞便,并用ELISA試劑盒檢測小鼠分泌型免疫球蛋白A(SIgA)的表達(dá)水平。小鼠加強(qiáng)免疫后一周后腹腔麻醉小鼠,隨后通過滴鼻給毒,包括豬流感H9N2和H1N1,選用兩種病毒是為了證明M2e保守基因在不同亞型之間的保守性。給毒后觀察小鼠的精神狀態(tài)并記錄小鼠的體重變化,攻毒后14天眼球采血,利用ELISA試劑盒檢測各組小鼠血液中IL-4和IFN-γ的分泌情況。并分析免疫后和攻毒后各組IL-4和IFN-γ的分泌情況的變化。從而進(jìn)一步驗(yàn)證重組乳酸菌對小鼠的免疫保護(hù)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:與PBS組相比,免疫重組乳酸菌pSIP409-3M2e-Fc(Fc未突變)和pSIP409-3M2e-Fc(Fc已突變)以及pSIP409-3M2e后小鼠腸系膜淋巴結(jié)和潘氏小結(jié)的CD95+PNA+B220+IgA+指標(biāo)均明顯提高,并且SIgA的表達(dá)水平也明顯增加。且免疫后與攻毒后相比,IL-4的表達(dá)量有所下降,而IFN-γ的表達(dá)量有所上升。通過指標(biāo)監(jiān)測,精神狀態(tài)觀察等結(jié)果證實(shí)了pSIP409-3M2e-Fc(Fc未突變)和pSIP409-3M2e-Fc(Fc已突變)以及pSIP409-3M2e對不同亞型流感病毒均有保護(hù)作用,且融合了未突變的Fc基因的重組乳酸菌免疫保護(hù)效果更好。結(jié)論:綜合來看本試驗(yàn)結(jié)果證明了pSIP409-3M2e-Fc(Fc未突變)組免疫保護(hù)性優(yōu)于pSIP409-3M2e-Fc(Fc已突變)組及pSIP409-3M2e組,且其免疫水平均高于其它對照組,說明Fc作為一種佐劑具有增強(qiáng)疫苗免疫效果的作用,同時表明基因融合重組乳酸菌具有抵抗SIV攻擊的能力,為免疫增強(qiáng)型豬流感基因工程乳酸菌口服疫苗的研制提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:The recombinant plasmids pSIP409 , pSIP409 - 3M2e , pSIP409 - 3M2e - Fc ( Fc had been mutated ) were synthesized . The results showed that the recombinant plasmid pSIP409 - 3M2e , pSIP409 - 3M2e - Fc ( Fc non - mutated ) and pSIP409 - 3M2e - Fc ( Fc had been mutated ) . The results showed that the recombinant plasmid pSIP409 - 3M2e , pSIP409 - 3M2e - Fc ( Fc non - mutated ) and pSIP409 - 3M2e - Fc ( Fc had been mutated ) . ( 2 ) The immune protective effect of recombinant lactic acid bacteria pSIP409 - 3M2e - Fc was detected by using ELISA kit to detect the secretion of IL - 4 and IFN - 緯 in mice .

【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S855.3

【參考文獻(xiàn)】

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2 那淑敏,賈士芳,陳秀珠,陳美玲,還連棟,郭興華,李金波,李金燕,劉軍;嗜酸乳桿菌產(chǎn)生的廣譜抗菌肽AP311的分離和鑒定[J];微生物學(xué)報(bào);2001年04期

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本文編號：1719853