本文選題：血管平滑肌細(xì)胞　切入點(diǎn)：成骨樣變　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:血管鈣化是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)、高血壓、血管成形術(shù)后再狹窄等血管重塑性疾病中普遍存在的病理表現(xiàn)。其主要特征是血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)向成骨樣表型(osteoblast-like phenotype)轉(zhuǎn)化,骨基質(zhì)相關(guān)蛋白如骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)-2、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)等表達(dá)增加。近年的一些研究表明,自噬過(guò)程對(duì)于血管鈣化的發(fā)生發(fā)展具有明顯的抑制作用,在磷酸鹽誘導(dǎo)的VSMC鈣化模型中,自噬誘導(dǎo)劑丙戊酸可以減少血管鈣化,而自噬抑制劑3-MA能夠促進(jìn)鈣化。但是,自噬抑制血管鈣化發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)利用小鼠頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)誘導(dǎo)血管內(nèi)膜增生模型以及血小板源生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor,PDGF-BB)誘導(dǎo)VSMC增殖模型,探討自噬對(duì)VSMC成骨樣變的影響及其作用機(jī)制。方法:1小鼠內(nèi)膜增生模型制備與分組選取8~12周的LDLR-/-小鼠,雄性,25只,隨機(jī)分為3 d、7 d、14 d、28 d和假手術(shù)組,異氟烷吸入式麻醉,體式顯微鏡下行左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù),假手術(shù)組只分離血管,不結(jié)扎,分別于結(jié)扎術(shù)后3、7、14、28 d時(shí)生理鹽水心臟灌流后取材。將取材的血管分為兩部分,一部分用OTC包埋劑包埋、液氮迅速冷凍、冰凍切片,備用;另一部分-80℃保存,Western Blot備用。2 VSMC培養(yǎng)與分組貼塊法培養(yǎng)大鼠VSMC,取3-5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)24 h后,分別給予PDGF-BB(10 ng/ml)刺激不同時(shí)間(6、12、24、48、72 h)后,收集細(xì)胞。或者根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要分別給予3-MA(10n M)或雷帕霉素(100n M)預(yù)孵育。3 Western Blot分析將收集的血管組織或細(xì)胞用RIPA裂解液裂解,提取總蛋白質(zhì),Western Blot檢測(cè)鈣化標(biāo)志蛋白ALP、BMP2以及AMP依賴(lài)的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)的表達(dá)。4冰凍切片免疫熒光染色分析選取結(jié)扎不同時(shí)間血管組織的冰凍切片,進(jìn)行組織免疫熒光染色,激光共聚焦顯微鏡下觀察自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)、哺乳動(dòng)物中ATG6的同源類(lèi)似物(homolog of ATG6 in mammalian cells,Beclin1)的表達(dá)。結(jié)果:1內(nèi)膜損傷后對(duì)血管細(xì)胞成骨樣變和自噬的影響LDLR-/-小鼠結(jié)扎不同時(shí)間后取材,HE染色結(jié)果顯示,隨著結(jié)扎時(shí)間的延長(zhǎng),內(nèi)膜逐漸增厚,管腔狹窄,中膜SMC排列紊亂,I/M比值增加,在結(jié)扎28 d時(shí)達(dá)到高峰。隨后檢測(cè)骨化標(biāo)志蛋白ALP與BMP2的表達(dá)情況,Western Blot結(jié)果顯示,隨著結(jié)扎時(shí)間的延長(zhǎng),ALP與BMP2的表達(dá)均逐漸增加,結(jié)扎14 d時(shí)達(dá)到高峰,28 d有所降低。進(jìn)一步觀察內(nèi)膜損傷對(duì)血管自噬的影響,免疫熒光染色結(jié)果顯示,隨著結(jié)扎時(shí)間的延長(zhǎng),自噬標(biāo)志蛋白Beclin1與LC3的表達(dá)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),在結(jié)扎7 d時(shí)達(dá)到高峰,28 d恢復(fù)到正常水平。2自噬抑制劑3-MA對(duì)內(nèi)膜損傷誘導(dǎo)的血管細(xì)胞成骨樣變的影響免疫熒光染色結(jié)果顯示,與結(jié)扎組相比,結(jié)扎后3-MA孵育組血管中膜Beclin1與LC3的表達(dá)均明顯減少。Western Blot結(jié)果顯示,與結(jié)扎組相比,結(jié)扎后3-MA孵育組血管細(xì)胞內(nèi)ALP與BMP2的表達(dá)均明顯升高。隨后觀察了3-MA對(duì)內(nèi)膜增生的影響,HE結(jié)果顯示,與結(jié)扎組相比,結(jié)扎后3-MA孵育組血管I/M比值明顯升高。3自噬抑制VSMC成骨樣變的機(jī)制研究用10 ng/m L的PDGF-BB處理VSMC不同時(shí)間,Western Blot結(jié)果顯示,隨刺激時(shí)間的延長(zhǎng),AMPK的表達(dá)增加,24 h達(dá)到高峰,72 h仍維持在較高水平。分別用自噬抑制劑3-MA和自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素處理細(xì)胞后,Western Blot結(jié)果顯示,3-MA可明顯抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的AMPK表達(dá),而雷帕霉素可以促進(jìn)其表達(dá)。并且,3-MA可以促進(jìn)PDGF-BB誘導(dǎo)的ALP活性。結(jié)論:1血管內(nèi)膜損傷后,細(xì)胞自噬先被誘導(dǎo),進(jìn)而促進(jìn)血管成骨樣變,引起血管內(nèi)膜增生;2抑制血管細(xì)胞自噬可以促進(jìn)血管鈣化與血管內(nèi)膜增生;3自噬可能通過(guò)誘導(dǎo)AMPK的表達(dá),抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC成骨樣變。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R54

【參考文獻(xiàn)】

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1 陸立鶴;顏建云;于匯民;劉筱靄;;自噬參與氧化性低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化[J];中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版);2010年06期

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本文編號(hào)：1718829