本文選題：正己烷　切入點(diǎn)：周圍神經(jīng)病變　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究目的正己烷(n-Hexane)是工業(yè)生產(chǎn)中一種常用的有機(jī)溶劑,主要用作粘合劑、油漆的生產(chǎn)原料,植物油的提取劑以及電子產(chǎn)業(yè)中的清潔劑。研究顯示長期低濃度的正己烷暴露可導(dǎo)致職業(yè)中毒的發(fā)生,以感覺運(yùn)動(dòng)型周圍神經(jīng)損傷為主要臨床特征。早期表現(xiàn)為肢體遠(yuǎn)端發(fā)麻、刺痛、蟻?zhàn)吒?手足發(fā)涼多汗、觸覺減退,多成對(duì)稱性分布,進(jìn)一步發(fā)展可表現(xiàn)為肌力減退、下肢行走困難,嚴(yán)重了造成肌肉萎縮和癱瘓。1957年意大利報(bào)道了首例制鞋工人正己烷神經(jīng)中毒的案例,隨后日本、美國、加拿大、韓國、巴西等國家也相繼出現(xiàn)了集體性正己烷職業(yè)病中毒的報(bào)道。中國從上世紀(jì)70-80年代開始發(fā)生正己烷中毒,隨后逐年不斷增加。正己烷導(dǎo)致神經(jīng)病變的發(fā)生主要通過其代謝產(chǎn)物2,5-己二酮(2,5-HD)介導(dǎo),但其分子機(jī)制至今尚不明確且無特效藥物治療。經(jīng)對(duì)癥治療,一般需半年至一年才能恢復(fù)健康,部分嚴(yán)重中毒病例不能完全恢復(fù)。由于正己烷慢性中毒患者以中青年居多,不僅嚴(yán)重?fù)p害了患者本人的身心健康,同時(shí)也給家庭和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,開發(fā)安全有效正己烷中毒防治藥物,既有利于其治療,又可進(jìn)一步闡明其中毒機(jī)制,具有非常重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。二烯丙基三硫(DATS)是大蒜的一種重要活性成分,具有抗腫瘤、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多重功效,還能夠?qū)Χ喾NP450酶起到調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)室之前的研究表明大蒜油對(duì)正己烷中毒具有保護(hù)作用,其機(jī)制與影響正己烷代謝和抵抗氧化應(yīng)激有關(guān),而大蒜油中DATS的含量占到50%以上,因此DATS有可能是大蒜油發(fā)揮拮抗正己烷毒性的活性成分。綜合DATS多重功效及其對(duì)代謝的調(diào)節(jié)作用,我們認(rèn)為其可能是大蒜油拮抗正己烷中毒的活性成分。胱胺是一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的氨基二硫化物,對(duì)帕金森氏癥(PD)、亨廷頓氏病(HD)、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)等多種神經(jīng)退行性疾病具有很好的預(yù)防和治療作用。胱胺不但能夠促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌,而且具有抗氧化、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、抵抗神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)等多重功效但是至今為止尚沒有關(guān)于胱胺預(yù)防和治療外源化學(xué)物引起的周圍神經(jīng)病變的報(bào)道。因此,本研究為了探討DATS和胱胺對(duì)正己烷神經(jīng)損傷的保護(hù)作用,分別通過正己烷和2,5-HD經(jīng)口灌胃染毒建立正己烷周圍神經(jīng)損傷模型,給予DATS和胱胺干預(yù),通過相關(guān)行為學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)其干預(yù)效果;并進(jìn)一步分別從代謝和分子生物學(xué)角度對(duì)DATS和胱胺發(fā)揮作用的機(jī)制進(jìn)行了探討。最后,通過DATS和胱胺的聯(lián)合給藥,評(píng)價(jià)其共同拮抗正己烷中毒性周圍神經(jīng)病的效果。研究方法1.DATS對(duì)慢性正己烷神經(jīng)損傷的保護(hù)作用Wistar大鼠72只,隨機(jī)分為6組,即對(duì)照組、模型組、DATS對(duì)照組、低中高劑量DATS干預(yù)組。DATS對(duì)照組(30 mg/kg)和低中高劑量DATS組(10,20,30 mg/kg)動(dòng)物每天經(jīng)口給予DATS,其余動(dòng)物給予等體積玉米油;2 h后,除對(duì)照組和DATS對(duì)照組外,其余動(dòng)物經(jīng)口給予正己烷(3 g/kg)。每周染毒7天,連續(xù)染毒8周至模型組動(dòng)物出現(xiàn)明顯癱瘓癥狀。每兩周測定一次四肢抓力,最后進(jìn)行步態(tài)評(píng)分對(duì)DATS的干預(yù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。在染毒結(jié)束前一周,從模型組和DATS干預(yù)組中每組隨機(jī)選取6只大鼠,于正己烷暴露后每2h經(jīng)頸靜脈取血分離血清,連續(xù)10次,每次0.4ml。通過氣相色譜法和埃利希反應(yīng)測定血清中的游離2,5-HD和吡咯加合物水平,采用DAS3.0對(duì)其毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析。動(dòng)物處死后,取肝、腎、腦、脊髓和坐骨神經(jīng)測定其中吡咯加合物的水平。取肝臟組織,利用RIPA裂解液勻漿后,離心取上清Western Blot檢測肝臟中正己烷代謝相關(guān)的CYP1A1、CYP1A2、CYP2B1/2和CYP2E1的蛋白含量。肝臟經(jīng)TMS緩沖液勻漿后超速離心制備微粒體,測定CYP1A1、CYP1A2、CYP2B1 和 CYP2E1 的活性。2.胱胺對(duì)慢性正己烷神經(jīng)損傷的保護(hù)作用Wistar大鼠50只,隨機(jī)分為5組,即對(duì)照組、模型組、胱胺對(duì)照組、低高劑量胱胺干預(yù)組。胱胺對(duì)照組(60 mg/kg)、低高劑量胱胺組(30 mg/kg、60 mg/kg)動(dòng)物經(jīng)腹腔注射給予胱胺,其余動(dòng)物給予等體積生理鹽水;2h后,除對(duì)照組和胱胺對(duì)照組外,其余動(dòng)物經(jīng)口給予2,5-HD(300 mg/kg)。每周染毒6天,連續(xù)染毒6周至模型組動(dòng)物出現(xiàn)明顯癱瘓癥狀。每周采用步態(tài)評(píng)分和加速轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)對(duì)胱胺的干預(yù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。病理學(xué)檢查:大鼠經(jīng)麻醉后心臟灌注固定,制備坐骨神經(jīng)石蠟切片,行固藍(lán)染色觀察病理改變。分別采用Elisa法檢測血清中BDNF的含量,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測脊髓中BDNFmRNA 的含量,Western blot 檢測脊髓中 BDNF、PI3K/Akt、Hsp-70 蛋白的表達(dá)。3.DATS和胱胺聯(lián)合作用對(duì)正己烷神經(jīng)損傷的保護(hù)效果Wistar大鼠40只,隨機(jī)分為4組,即正己烷模型組、胱胺干預(yù)組、DATS干預(yù)組、DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組。胱胺干預(yù)組、DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組動(dòng)物經(jīng)腹腔注射給予胱胺(60mg/kg);DATS干預(yù)組、DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組經(jīng)口灌胃給予DATS(30 mg/kg);其余動(dòng)物給予等體積溶劑。2 h后,各組動(dòng)物均經(jīng)口給予正己烷(3 g/kg)。每周染毒7天,連續(xù)染毒8周至模型組動(dòng)物出現(xiàn)明顯癱瘓癥狀,每兩周進(jìn)行一次加速轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)和鼠尾電生理測試評(píng)價(jià)DATS和胱胺聯(lián)合作用對(duì)正己烷神經(jīng)損傷的保護(hù)效果。研究結(jié)果1.DATS對(duì)慢性正己烷神經(jīng)損傷的保護(hù)作用1.1 DATS對(duì)正己烷染毒大鼠行為學(xué)的影響四肢抓力:與對(duì)照組相比,正己烷染毒大鼠自6周起開始出現(xiàn)明顯下降。染毒結(jié)束時(shí),與模型組相比低、中、高劑量DATS干預(yù)使得大鼠四肢抓力分別提升了 7.9%,41.6%和 63.1%(P0.05);步態(tài)評(píng)分:染毒結(jié)束時(shí),模型組大鼠步態(tài)出現(xiàn)明顯異常,步態(tài)評(píng)分升至3.25±0.87;10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg DATS 干預(yù)組步態(tài)評(píng)分改善為 3.17±0.83,2.33± 1.07(P0.05),1.67±0.49(P0.01)。1.2 DATS對(duì)正己烷染毒大鼠血清中2,5-HD和吡咯加合物毒代動(dòng)力學(xué)的影響與模型組大鼠相比,10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg DATS干預(yù)組2,5-HD曲線下面積(AUC0-t)分別下降了 3.3%,17.1%和37.4%(P0.05),而吡咯加合物曲線下面積下降了 6.9%,7.0%和26.5%(P0.05);血清中2,5-HD的最大濃度(Cmax)下降了 11.7%,17.4%和30.3%,而吡咯加合物最大濃度(Cmax)下降了9.4%,9.4%和 25.8%(P0.05)。1.3 DATS對(duì)正己烷染毒大鼠組織中吡咯加合物蓄積的影響與模型組相比,DATS干預(yù)使得各組織臟器中蓄積的吡咯加合物出現(xiàn)了不同程度的下降:10 mg/kg、20 mg/kg、3 0 mg/kg DATS干預(yù)組大鼠肝臟中吡咯加合物下降了 2.0%,5.6%和16.1%;腎臟中吡咯加合物下降了 8.0%,21.6%和29.2%;大腦中吡咯加合物下降了 9.9%,21.3%和22.3%;脊髓中吡咯加合物下降了19.7%,24.4%和41.5%;坐骨神經(jīng)中吡咯加合物下降了 10.0%,15.3%和27.1%。20 mg/kg、30 mg/kg DATS干預(yù)組大鼠腎臟、大腦、脊髓和坐骨神經(jīng)中吡咯加合物的下降均較模型組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05或P0.01)。1.4 DATS對(duì)正己烷染毒大鼠肝臟中相關(guān)代謝酶含量的影響與模型組相比,DATS干預(yù)使得CYP1A1的表達(dá)增加,CYP1A2、CYP2B1/2和CYP2E1的表達(dá)降低。10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg DATS干預(yù)使肝臟中CYP1A1 分別增加了 0.3%、9.2%和 54.2%(P0.05);CYP1A2 降低了 12.8%、24.5%和 23.2%;CYP2B1/2 降低了-6.9%、15.1%和 27.4%(P0.01);CYP2E1降低了 27.9%(P0.05)、32.1%(P0.05)和 43.5%(P0.01)。1.5 DATS對(duì)正己烷染毒大鼠肝臟中相關(guān)代謝酶活性的影響與模型組相比,DATS干預(yù)使得CYP1A1活性增強(qiáng),CYP2B1和CYP2E1的活性減弱。其中20 mg/kg和30 mg/kg DATS干預(yù)使肝臟中CYP1A1活性增加了23.4%(P0.05)和29.5%(P0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;30mg/kg DATS干預(yù)使得 CYP2B1 活性降低了 23.1%(P0.01);10 mg/kg、20 mg/kg 和 30 mg/kg DATS干預(yù)使得CYP2E1分別降低了 25.6%、30.4%和39.9%,差異均具有顯著性(P0.05 或P0.01)。2.胱胺對(duì)慢性正己烷神經(jīng)損傷的保護(hù)作用2.1胱胺對(duì)2,5-HD染毒大鼠行為學(xué)的影響步態(tài)評(píng)分:60 mg/kg和30 mg/kg胱胺干預(yù)組分別自第二周和第三周開始與模型組表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。染毒結(jié)束時(shí),模型組7/10的大鼠完全癱瘓,30 mg/kg干預(yù)組1/10的大鼠完全癱瘓,60 mg/kg干預(yù)組未有完全癱瘓的大鼠;30 mg/kg和60 mg/kg干預(yù)組大鼠的步態(tài)評(píng)分結(jié)果較模型組分別下降了 24.3%(P0.01)和 37.8%(P0.01)。加速轉(zhuǎn)棒試驗(yàn):與模型組相比,60 mg/kg和30 mg/kg胱胺干預(yù)組分別自第3周和第5周開始與2,5-HD模型組表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。染毒結(jié)束時(shí),模型組大鼠基本上不能在轉(zhuǎn)棒上停留,30 mg/kg和60 mg/kg干預(yù)組大鼠的潛伏期分別較模型組提升了 216.8%(P0.05)和325.7%(P0.01)。2.2血清和脊髓組織中BDNF蛋白含量以及脊髓組織中BDNF mRNA含量的改變與對(duì)照組相比,模型組血清中BDNF的含量降低了 31.4%(P0.01),脊髓中mature-BDNF的含量下降了 37.6%(P0.01),脊髓中BDNF mRNA的含量降低了 52.1%(P0.05)。與模型組相比,30 mg/kg和60mg/kg胱胺干預(yù)組血清中BDNF的含量分別提高了 18.1%(P0.05)和38.9%(P0.01),脊髓組織中precursor-BDNF 的含量較模型組提高了 8.2%和 29.3%(P0.01),mature-BDNF提高了 107.2%(P0.01)和 300.5%(P0.01),脊髓組織中 BDNF mRNA 含量約為模型組的2,1倍和2.7倍。2.3脊髓組織中PI3K/Akt信號(hào)通路及Hsp-70蛋白含量的改變與模型組相比,30mg/kg、60mg/kg胱胺干預(yù)使得脊髓中p-PI3K/PI3K比率提升了 110.6%和179.6%,p-Akt/Akt比率提升了 112.7%,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);脊髓中Hsp-70的表達(dá)分別提高了 21.1%和39.7(P0.05)。3.DATS和胱胺聯(lián)合作用對(duì)正己烷神經(jīng)損傷的保護(hù)效果加速轉(zhuǎn)棒試驗(yàn):胱胺干預(yù)組、DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組自第4周開始與模型組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;DATS干預(yù)組自第6周開始與模型組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組分別自第4周、第6周與DATS干預(yù)組、胱胺干預(yù)組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。至染毒結(jié)束時(shí),DATS干預(yù)組、胱胺干預(yù)組和DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組潛伏期分別提升至模型組的2.7倍、3.3倍和5.2倍;DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組潛伏期較DATS干預(yù)組組提高了 95.2%,較胱胺干預(yù)組提高了 60.0%。鼠尾電生理:DATS干預(yù)組、胱胺干預(yù)組和DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組分別自第6周、第6周和第4周開始與模型組出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組自第4周與DATS干預(yù)組、胱胺干預(yù)組出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。染毒結(jié)束時(shí)DATS干預(yù)組、胱胺干預(yù)組和DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組NCV分別較模型組提升了 19.8%、23.5%和51.3%;DATS胱胺聯(lián)合干預(yù)組潛伏期較DATS干預(yù)組組提高了 26.3%,較胱胺干預(yù)組提高了 22.5%。結(jié)論1.DATS可有效拮抗慢性正己烷中毒所致的周圍神經(jīng)損傷,可能與其抑制正己烷代謝活化,促進(jìn)其代謝解毒,降低2,5-HD的量有關(guān)。2.胱胺可以拮抗大鼠正己烷中毒模型的神經(jīng)損傷,其機(jī)制可能是與抑制2,5-HD引起的BDNF含量下降、激活PI3K/Akt信號(hào)通路以及上調(diào)Hsp-70的表達(dá)有關(guān)。3.DATS和胱胺聯(lián)合作用可以更有效的拮抗正己烷所致的周圍神經(jīng)損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R135.1
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本文編號(hào)：1716847