發(fā)布時(shí)間：2018-04-02 16:35

  本文選題：脾氣虛　切入點(diǎn)：神疲乏力　出處：《遼寧中醫(yī)藥大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：目的:運(yùn)用分子生物學(xué)等方法與技術(shù),探討脾氣虛證模型大鼠海馬CA3區(qū)組織呼吸鏈復(fù)合物活性與相關(guān)信號(hào)通路分子表達(dá)變化,同時(shí)觀察四君子湯對(duì)其干預(yù)的影響,旨為“脾主運(yùn)化”理論的腦中樞可能機(jī)制,以及“益氣健脾”法的生物學(xué)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料與方法:1.動(dòng)物模型復(fù)制與成模評(píng)價(jià):健康SPF級(jí)Wistar雄性大鼠60只,以隨機(jī)數(shù)字法分為正常組、模型組、四君子湯治療組。分組:隨機(jī)分為正常組,脾氣虛證模型組,四君子湯治療組。模型復(fù)制:依據(jù)文獻(xiàn),選用中醫(yī)病因復(fù)合造模方法,即飲食不節(jié)與勞倦過度法。飲食不節(jié)模型建立:即模型組3天為一循環(huán),先飽食1天,再禁食2天,自由飲水;勞倦過度:每日游泳至力竭(至大鼠沒入水中無法上浮),水溫35~37℃,連續(xù)15天。后兩組動(dòng)物按上述制模方法處理,連續(xù)15天,正常組不加任何刺激,正常飼養(yǎng)。第十六天,依據(jù)脾氣虛模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),大鼠復(fù)合標(biāo)準(zhǔn)后即為成功造膜。根據(jù)文獻(xiàn)脾氣虛證評(píng)定標(biāo)準(zhǔn):主癥:(1)神疲、倦怠;(2)肢體乏力;次癥:(3)體質(zhì)量下降;(4)食量減少;(5)體溫下降或略有降低;(6)便軟或溏;動(dòng)物同時(shí)滿足兩個(gè)主癥及兩個(gè)次癥,判斷脾氣虛模型造膜成功。2.四君子湯治療方法與時(shí)間:選用湖北廣仁藥業(yè)有限公司生產(chǎn)四君子丸(批號(hào):國藥準(zhǔn)字Z42021149),清水溶解后常溫保存。模型成功后次日進(jìn)行治療,治療組大鼠以10g/Kg體重(相當(dāng)于生藥2g)2ml進(jìn)行灌胃,模型組灌服等容積生理鹽水,每日2次共治療2周,正常組常規(guī)喂養(yǎng)。3.脾氣虛證模型大鼠證候的量化方法:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后禁食不禁水12h按正常組、模型和治療組序輪流進(jìn)行核心指標(biāo)檢測。運(yùn)用曠場實(shí)驗(yàn)和“抓力”實(shí)驗(yàn)方法分別對(duì)模型大鼠“神疲、倦怠”“四肢乏力”等證候進(jìn)行客觀性量化;運(yùn)用代謝籠收集24h尿液、糞便,并運(yùn)用干燥法測定大便含水率;稱重法測量體重、飲食量、飲水量等變化。運(yùn)用電子體溫計(jì),插入直腸2厘米,測定大鼠體溫。4.胃腸運(yùn)動(dòng)推進(jìn)率檢測方法:在行為學(xué)檢測結(jié)束后,用10%水合氯醛行腹腔麻醉后,經(jīng)胃管注入1.0ml炭粉阿拉伯膠混懸液,18min后手術(shù)暴露胃與小腸,用丈量法檢測胃腸碳末推進(jìn)速度,并換算出推進(jìn)率。5.海馬CA3區(qū)取材方法:麻醉狀態(tài)下手術(shù)取出大腦,參考文獻(xiàn),進(jìn)行大鼠海馬3區(qū)解剖定位后切除、固定,分別進(jìn)行呼吸鏈復(fù)合物活性、蛋白、基因檢測;同時(shí),取出海馬CA3區(qū)組織進(jìn)行2.5%戊二醛和多聚甲醛試劑處理保存,分別留作透射電鏡和光鏡檢測。6.各指標(biāo)檢測方法:采用采用Western-Blot法和RT-PCR法檢測大鼠海馬GLUT3的蛋白和m RNA表達(dá);采用ELISA法檢測大鼠海馬組織VIP\c AMP\AMPK的含量;比色法測定海馬線粒體復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性,實(shí)時(shí)定量PCR檢測PKA基因表達(dá),Western-Blot法檢測ATP合酶的蛋白表達(dá),運(yùn)用免疫組化法檢測VIP2受體表達(dá)。7.數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)均以_X±S表示,采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,主要采用ANOVA進(jìn)行組間比較。結(jié)果:1.四君子湯對(duì)脾氣虛證模型大鼠行為學(xué)影響:與正常組比較,模型組體重(p0.05)、飲食量明顯下降(p0.05);雙前肢抓力降低(p0.05),曠場實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)距離和運(yùn)動(dòng)平均速度明顯減少和減慢(p0.05);垂直站立次數(shù)顯著減少(p0.05),曠場中心滯留時(shí)間明顯延長(p0.01)。與模型組比較,治療組大鼠上述各項(xiàng)觀察指標(biāo)均明顯得到改善,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理顯示出顯著性差異(p0.05)。胃腸碳末推進(jìn)率結(jié)果顯示,模型組明顯減慢(p0.01),藥物干預(yù)后得到糾正(p0.05)。2.四君子湯對(duì)脾氣虛證大鼠海馬CA3區(qū)形態(tài)學(xué)影響:透射電鏡結(jié)果顯示,正常組線粒體圓形或卵圓形,包膜清楚,神經(jīng)細(xì)胞外膜平滑;與正常組比較,模型組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元線粒體腫脹,并出現(xiàn)空泡化;治療組線粒體形態(tài)無明顯改變,無空泡顯現(xiàn),神經(jīng)細(xì)胞外膜平滑。3.四君子湯對(duì)脾氣虛證大鼠海馬CA3區(qū)組織VIP含量及受體表達(dá)影響:與正常組比較,模型組大鼠海馬CA3區(qū)組織VIP含量及其VIP受體表達(dá)光密度值均出現(xiàn)明顯下降和下調(diào)(p0.01);與模型組比較,治療組VIP含量及其受體表達(dá)均升高和上調(diào)(p0.01)。4.四君子湯對(duì)脾氣虛證大鼠海馬CA3區(qū)細(xì)胞膜GLUT3表達(dá)影響:葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體3(GLUT3)多分布于中樞神經(jīng)細(xì)胞膜,是細(xì)胞膜外葡萄糖分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵性蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常組比較,模型組大鼠海馬CA3區(qū)細(xì)胞膜GLUT3m RNA的表達(dá)下調(diào)(p0.01),GLUT3蛋白表達(dá)減少(p0.01);與模型組比較治療組GLUT3m RNA表達(dá)上調(diào)(p0.01):GLUT3蛋白表達(dá)則上調(diào)(p0.01)。5.四君子湯對(duì)脾氣虛證大鼠海馬CA3區(qū)組織呼吸鏈復(fù)合物活性影響:能量代謝需要線粒體呼吸鏈酶由4個(gè)復(fù)合物,因此檢測四個(gè)復(fù)合物活性可以檢測能量生成的效率,通過分別檢測各個(gè)復(fù)合物活性結(jié)果顯示:與正常組比較,模型組大鼠復(fù)合物Ⅰ活性下降(p0.01)、復(fù)合物Ⅲ活性下降(p0.01)、復(fù)合物Ⅳ活性下降(p0.01);與模型組比較,治療組復(fù)合物Ⅰ明顯升高(p0.01)、復(fù)合物Ⅲ明顯升高(p0.01)、復(fù)合物Ⅳ活性明顯升高(p0.01);復(fù)合物Ⅱ活性各組間沒有顯著性差異。6.四君子湯對(duì)脾氣虛證大鼠海馬CA3區(qū)組織ATP合酶表達(dá)影響:通過對(duì)ATP合酶免疫印跡的光密度積分分析結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組ATP合酶蛋白表達(dá)下調(diào)(P0.01);與模型組比較,治療組表達(dá)較模型組上調(diào)(P0.01)。7.四君子湯對(duì)脾氣虛證大鼠海馬CA3區(qū)c AMP-PKA-AMPK表達(dá)影響:實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與正常組比較,模型組大鼠海馬3區(qū)組織c AMP含量明顯減少(p0.01),與模型組比較,治療組c AMP含量增多(p0.01);通過對(duì)PKA m RNA表達(dá)結(jié)果顯示,與正常組比較,氣虛大鼠海馬組織PKAm RNA表達(dá)下調(diào)(p0.01),與模型組比較,治療組的PKAm RNA表達(dá)顯著上調(diào)(p0.01);通過對(duì)AMPK含量結(jié)果分析,海馬3區(qū)組織AMPK檢測結(jié)果表明,與正常組比較,模型組組織AMPK含量明顯增加(p0.01),與模型組比較,治療組MAPK含量減少(p0.01),并且與正常組已無顯著性差異。結(jié)論:1.脾氣虛證模型大鼠曠場試驗(yàn)中垂直站立次數(shù)減少、場中間區(qū)滯留時(shí)間延長;運(yùn)動(dòng)總距離減少和速度減慢,雙前肢抓力下降;四君子湯干預(yù)后能夠?qū)⑵淠孓D(zhuǎn)。2.脾氣虛證模型大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元線粒體腫脹,出現(xiàn)空泡化改變,四君子湯能夠使其逆轉(zhuǎn)。3.脾氣虛證模型大鼠海馬CA3區(qū)組織VIP含量減少,其受體表達(dá)下調(diào),四君子湯干預(yù)后能夠降低VIP水平、下調(diào)其受體表達(dá)。4.脾氣虛證模型大鼠海馬CA3區(qū)細(xì)胞膜GLUT3的表達(dá)下調(diào),四君子湯干預(yù)能夠使其上調(diào)。5.脾氣虛證模型大鼠海馬CA3區(qū)組織線粒體復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ活性以及ATP合酶蛋白表達(dá)下降;四君子湯能夠恢復(fù)其活性。6.脾氣虛證模型大鼠海馬CA3區(qū)組織c AMP-PKA AMPK信號(hào)分子含量及表達(dá)均減少和下調(diào),四君子湯干預(yù)后可使其逆轉(zhuǎn)。
[Abstract]:Objective : To study the expression of respiratory chain complexes and the expression of related signal pathways in hippocampus CA 3 of spleen - qi deficiency model rats by molecular biology , and to observe the effect of Sijunzi decoction on the biological basis of the theory of " spleen main transportation " . Methods : The contents of protein and mRNA of rat hippocampus were measured by means of Western - Blot and RT - PCR respectively . The expression of protein and mRNA was measured by means of Western - Blot and Western - Blot . The results showed that the expression of GLUT3m RNA was significantly decreased in the model group compared with the normal group ( P < 0.01 ) . The results showed that the expression of GLUT4 in the hippocampus of the model group was significantly decreased ( P < 0.01 ) . 澶嶅悎鐗┾叀媧繪，

本文編號(hào)：1701228