本文選題：周圍神經損傷　切入點：神經干細胞　出處：《重慶醫(yī)科大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分川芎嗪對基因修飾或缺血缺氧損傷鼠胚神經干細胞的保護作用 目的：構建SD乳鼠神經干細胞體外缺血缺氧損傷及基因修飾模型；探討TMP對神經干細胞基因修飾與缺血缺氧損傷的保護作用，以及TMP促進神經損傷修復，發(fā)揮神經保護作用的可能機制，為TMP作為神經干細胞保護劑提供細胞生物學理論依據(jù)。 方法：(1)分離SD乳鼠海馬神經干細胞(NSCs)進行原代培養(yǎng)，將二代NSCs行神經巢蛋白(Nestin)及誘導分化后的神經絲蛋白（NF-200）與膠質纖維酸性蛋白（GFAP）免疫熒光鑒定。取二代神經干細胞行攜帶EGFP基因的逆轉錄病毒轉染并更換完全培養(yǎng)基，然后按TMP實驗組、基因修飾對照組（GM control）、溶媒對照組（Vehicle control）分組，同時設正常對照組（Normal control）。其中TMP實驗組在DMEM/F12培養(yǎng)基中分別加入工作濃度為50、100、200和300μg/ml的TMP，溶媒對照組在DMEM/F12培養(yǎng)基中加入0.1%DMSO作為溶劑對照，正常對照組為未行基因修飾的二代神經干細胞。各組均在常規(guī)條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。通過MTT比色法、錐蟲藍染色計數(shù)及流式細胞儀檢測神經干細胞活力和損傷凋亡情況，Quantitative real-time PCR和Westernblotting方法檢測凋亡相關因子Bax，Bcl-2和Caspase-3的表達。 另取二代NSCs分為TMP實驗組（TMP group）、缺血缺氧對照組（OGDcontrol）、溶媒對照組（Vehicle control）和正常對照組（Normalcontrol）分別培養(yǎng)6h。其中缺血缺氧對照組、溶媒對照組和TMP實驗組均采用OGD（oxygen-glucose-deprivation）法構建體外缺血缺氧損傷模型，溶媒對照組在缺血缺氧造模前即給予0.1%DMSO作為溶劑對照，TMP實驗組則在造模前即刻分別加入工作濃度為50、100、200和300μg/ml的TMP，直至造模結束。正常對照組則不作任何處理在常規(guī)條件下培養(yǎng)6h。通過MTT比色法、錐蟲藍染色計數(shù)及流式細胞儀檢測神經干細胞活力和損傷凋亡情況，Quantitative real-time PCR和Western blotting方法檢測凋亡相關因子Bax，Bcl-2和Caspase-3的表達。 結果：（1）與正常對照組比較，溶媒對照組和基因修飾對照組NSCs活力均顯著降低，細胞死亡率及細胞凋亡率均顯著增高（均P＜0.05），而抑凋亡基因Bcl-2mRNA和蛋白表達下調，促凋亡基因Bax、Caspase-3mRNA和蛋白表達上調（均P＜0.05）；但基因修飾對照組與溶媒對照組組間比較上述指標無明顯差異（均P＞0.05）；與基因修飾對照組比較，TMP實驗組呈一定濃度依賴性，能濃度依賴地減少細胞死亡率及凋亡率，增強細胞增殖活性，且TMP可顯著上調基因修飾后NSCs中Bcl-2mRNA和蛋白表達水平，下調Bax、Caspase-3mRNA和蛋白表達水平，但基因修飾對照組和50、100μg/mlTMP組間無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05），200μg/mlTMP組與300μg/mlTMP組間未見明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。（2）與正常對照組比較，溶媒對照組和缺血缺氧對照組NSCs活力均顯著降低，細胞死亡率及細胞凋亡率均顯著增高（均P＜0.05），而抑凋亡基因Bcl-2mRNA和蛋白表達下調，促凋亡基因Bax、Caspase-3mRNA和蛋白表達上調（均P＜0.05）；但缺血缺氧對照組與溶媒對照組組間比較上述指標無明顯差異（均P＞0.05）；與缺血缺氧對照組比較，TMP實驗組呈一定濃度依賴性，能濃度依賴地減少細胞死亡率及凋亡率，增強細胞增殖活性，且TMP可顯著上調基因修飾后NSCs中Bcl-2mRNA和蛋白表達水平，下調Bax、Caspase-3mRNA和蛋白表達水平，但缺血缺氧對照組和50、100μg/mlTMP組間無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05），200μg/mlTMP組與300μg/mlTMP組間未見明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。 結論：TMP能夠濃度依賴性地對基因修飾后或缺血缺氧損傷的NSCs發(fā)揮保護作用，且該作用與其調控凋亡相關因子Bcl-2、Bax及Caspase-3的表達，抑制細胞凋亡有關，這可能是TMP對周圍神經系統(tǒng)發(fā)揮保護作用的相關機制之一。 第二部分含川芎嗪培養(yǎng)液對組織工程化神經橋接物生物學特性的影響 目的：化學法萃取Wistar大鼠脫細胞坐骨神經，構建種植基因修飾神經干細胞的組織工程化神經橋接物，探討含TMP培養(yǎng)基對橋接物生物學特性的影響，為移植修復周圍神經缺損提供理想的橋接體。 方法：（1）12只成年健康Wistar雄性大鼠，切取雙側坐骨神經（共24條），每條長約2cm，其中20條按下列順序進行化學處理:剝除外覆結締組織，無菌蒸餾水清洗3次。放入3%TritonX-100中震蕩24h后無菌蒸餾水清洗3次。放入4%脫氧膽酸鈉中室溫下震蕩24h后無菌蒸餾水清洗3次。④重復2~3步驟，直至形成的去細胞神經呈乳白色、半透明樣。HE染色、透射電鏡掃描觀察化學去細胞神經組織結構。⑤將化學去細胞神經放入DMEM/F12液中4℃保存?zhèn)溆�。�?）取12條去細胞神經水化后在顯微鏡下用微量加樣器注入10ul基因修飾神經干細胞懸液(2106/ml)后分I、II、III三組，I、II組各5條，III組2條，其中I、II組分別在常規(guī)DMEM/F12完全培養(yǎng)基和添加有200μg/mlTMP的完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)1周；取I、II、III三組各2條切片行熒光顯微鏡、HE染色與免疫組化（Nestin、NF-200、GFAP）染色觀察細胞分布與支架結構。（3）另取SD大鼠24只分A、B、C、D4組，每組6只，分別將4℃保存1周Wistar大鼠坐骨神經、I組組織工程化神經、II組組織工程化神經及同種異體SD大鼠坐骨神經依次包埋于皮下，7天后取出各組移植神經行HE染色光鏡觀察及CD4+和CD8+淋巴細胞侵潤數(shù)量檢測。另取SD大鼠24只分A、B、C、D4組，每組6只，分別將4℃保存1周Wistar大鼠坐骨神經、I組組織工程化神經、II組組織工程化神經及同種異體SD大鼠坐骨神經依次包埋于皮下，7天后取出各組移植神經行HE染色光鏡觀察及CD4+和CD8+淋巴細胞侵潤數(shù)量檢測。 結果：去細胞神經的橫切片上可見神經外膜和神經束膜形成的圓形結構,其內部為松散的膠原成分髓鞘及細胞成分基本消失。神經外膜和細胞基底膜結構均較完整�？v切片上可見較多整，齊排列的管道樣結構，基本無細胞成分。注射神經干細胞后縱切片上可見神經外膜下和束膜間有較多細胞成份，分布不均。培養(yǎng)1周后兩組均有較多增殖與分化神經細胞，基因修飾神經干細胞在去細胞橋神經中生長良好，并且有遷移成行的特性，但II組更明顯，與I組差異有顯著性（P＜0.05）。皮下包埋后光鏡下見藍色淋巴細胞浸潤依次減少，A、B、C組間均有顯著差異。C、D組間無顯著差異。神經內CD4+和CD8+淋巴細胞侵潤數(shù)A組最多，D組最少，，A、B、C組間均有顯著差異。C、D組間無顯著差異。 結論：異體神經化學萃取法可去除神經中的細胞和髓鞘而保留完整的神經基底膜管和纖維支架結構，并且對神經基底膜主要成分-層粘連蛋白無明顯影響。種植神經干細胞并在含TMP培養(yǎng)基中培養(yǎng)后制作的組織工程化神經具有較低免疫原性及正常神經的三維結構，可能成為一種理想的組織工程化人工神經，作為修復周圍神經缺損的橋接物。 第三部分川芎嗪預處理組織工程化神經橋接物修復大鼠坐骨神經缺損的實驗研究 目的：研究川芎嗪預處理對組織工程化神經橋接物修復大鼠1.5cm坐骨神經缺損的效果。 方法：分別按前述方法制作基因修飾的SD大鼠神經干細胞、脫細胞的Wistar大鼠坐骨神經、種植神經干細胞并在含川芎嗪培養(yǎng)基中共培養(yǎng)1周的組織工程化神經。將55只200-250克成年雌性SD大鼠分為A、B、C、D共4組，A、B、C組各15只，D組10只，實驗側均為右后肢坐骨神經。1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,顯露坐骨神經,從梨狀肌下緣0.5cm處切除神經1.5cm,分別用4種移植物橋接大鼠1.5cm坐骨神經缺損:含川芎嗪的組織工程化神經組（A組）、脫細胞異體神經組（B組）、異體神經組（C組）、自體神經組（D組）。術后A組術側小腿三頭肌內注射TMP液（16mg/kg/日），其余各組（B、C、D組）注射相同體積0.9%NS，連續(xù)注射12周至實驗結束。術后2周、12周通過大體觀察、神經電生理檢測、肌肉濕重稱重、熒光顯微鏡觀察、辣根過氧化物酶（HRP）逆行示蹤及組織學指標評價各組修復神經缺損的效果。 結果：術后12周大體觀察發(fā)現(xiàn)A、D組實驗側足趾明顯散開，足趾印跡分散，恢復足爪著地行走，右后肢蹬力良好，明顯優(yōu)于B、C組；A組坐骨神經功能指數(shù)測定、運動神經傳導速度和肌肉濕重恢復均優(yōu)于B、C組（P0.05），略差于D組（P0.05）；熒光顯微鏡與免疫組化染色檢測發(fā)現(xiàn)，NSCs能在體內存活、遷移并分化為神經元和膠質細胞，A組優(yōu)于B、C組；術后12周辣根過氧化物酶（HRP）逆行示蹤檢測提示A組脊神經節(jié)中HRP標記的細胞數(shù)較B、C組多（P0.05），甲苯胺藍染色發(fā)現(xiàn)A組移植段再生神經纖維較多,以有髓神經纖維為主，明顯優(yōu)于B、C組（P0.05）。 結論：種植神經干細胞并在含川芎嗪培養(yǎng)液中培養(yǎng)1周的脫細胞異體神經構成的組織工程化神經橋接物能有效修復大鼠坐骨神經缺損，促進周圍神經再生及下肢運動功能的恢復。
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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R745

【參考文獻】

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本文編號：1640413