本文選題：脫氫表雄酮　切入點：蛋白聚糖酶　出處：《浙江大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：骨關節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是多種因素共同作用下所致的退行性關節(jié)疾病,主要表現(xiàn)是關節(jié)疼痛和活動受限,最終導致患者活動能力下降甚至喪失。OA在老年人群中的發(fā)病率很高,據(jù)報道,我國60歲以上人群中,OA的發(fā)病率達50%,而75歲以上人群中,其發(fā)病率高達80%,且近年來OA的發(fā)病率和致殘率仍在不斷升高。此外,由于疾病早期缺乏癥狀而不易察覺,當出現(xiàn)明顯癥狀時疾病多進入中晚期,軟骨已發(fā)生不可逆性損害。因此多數(shù)患者因為疼痛、關節(jié)功能喪失而不得不接受人工關節(jié)置換手術。由此可見,OA已經(jīng)成為威脅老年人群公共健康和生活質量的重大醫(yī)學問題。蛋白聚糖酶(aggrecanase)是近幾年最新克隆分離出的酶類,是帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解整鏈蛋白金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS)家族成員。近期研究發(fā)現(xiàn) aggrecanase-1(ADAMTS-4)與aggrecanse-2(ADAMTS-5),OA疾病早期就參與了軟骨蛋白聚糖(aggrecan)的降解,與疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系,而同時抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5可以有效防止OA軟骨細胞外基質(ECM)降解,防止軟骨的退行性變。組織因子機制金屬蛋白酶抑制劑-3(tissue inhibitor of metalloproteinases-3,TIMP-3)已被證明對于ADAMTS-4/5的活性具有較強的抑制作用,是關節(jié)軟骨中ADAMTS-4/5的天然抑制劑,調(diào)節(jié)其活性。因此,ADAMTS/TIMP-3系統(tǒng)平衡對OA的發(fā)展起著至關重要的作用。而將此系統(tǒng)作為藥物干預的靶點,從而觀察經(jīng)過干預后對疾病發(fā)展的作用,已經(jīng)成為新型抗OA藥物研制的策略。脫氫表雄酮(DHEA)是腎上腺皮質網(wǎng)狀帶分泌的一種甾體類激素,它在血漿中的濃度隨著年齡的增長而降低。近幾年,國外有學者開始從事DHEA離體實驗和在體實驗的研究,其研究結果提示DHEA對OA關節(jié)軟骨可能有保護作用,然而具體機制尚不明確。本研究通過建立新西蘭大白兔膝OA模型,并研究關節(jié)腔內(nèi)注射DHEA對退變關節(jié)軟骨的作用,并探討相關作用機制。本次研究主要分成四部分:一、首先明確新西蘭大白兔OA模型隨疾病發(fā)展關節(jié)軟骨形態(tài)學改變特征。二、脫氫表雄酮對兔中期及晚期OA的軟骨形態(tài)學改善作用。三、脫氫表雄酮對兔OA軟骨ADAMTS/TIMP-3酶系統(tǒng)的影響。我們的研究結果表明DHEA對OA關節(jié)軟骨具有保護作用,且這種保護作用具有時間依賴性和部位特殊性,而其中的作用機制可能是通過抑制軟骨中的侵襲因子ADAMTS-4和ADAMTS-5的分泌,促進保護因子TIMP-3、TGF-β1的表達,阻止細胞外基質主要成分Aggrecan及Collagen Ⅱ的降解來實現(xiàn)的。本研究結果為臨床治療OA提供了 一種新思路。第一部分新西蘭大白兔OA模型建立及疾病發(fā)展特征目的:觀察前交叉韌帶離斷法(ACLT)建立新西蘭大白兔模型關節(jié)軟骨形態(tài)學改變的特征。方法:正常新西蘭大白兔采用3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉,雙側膝關節(jié)常規(guī)消毒鋪巾后行ACLT,術后分籠不制動飼養(yǎng)。分別在術后9周和16周麻醉處死后,迅速解剖雙側膝關節(jié),將膝關節(jié)置于顯微外科用手術顯微鏡下肉眼進行軟骨大體形態(tài)損傷評分。結果:在ACLT后9周,我們發(fā)現(xiàn)關節(jié)軟骨表層不平整,表中層番紅染色減退,軟骨細胞排列不規(guī)則(相當于中期OA的表現(xiàn))。在ACLT后16周,軟骨全層破壞,部分標本可見軟骨下骨外露以及關節(jié)邊緣的巨大骨贅,軟骨細胞排列紊亂,軟骨全層番紅染色丟失(相當于晚期OA的表現(xiàn))。結論:ACLIT術后,關節(jié)軟骨進行性退變,隨著飼養(yǎng)的時間增加,OA的病理改變也逐漸加重。第二部分脫氫表雄酮對兔OA中期及晚期的軟骨形態(tài)學改善作用目的:明確關節(jié)腔內(nèi)注射DHEA對中期及晚期OA關節(jié)軟骨的形態(tài)學改善作用,并明確這種形態(tài)學改善作用的特征。方法:30只成年雄性新西蘭大白兔納入實驗,其中20只行雙側膝ACLT造成關節(jié)不穩(wěn)建立動物膝OA模型。術后4周,所有模型動物左膝關節(jié)腔內(nèi)注射100 μmol/L DHEA(實驗組),右膝關節(jié)腔內(nèi)注射相同劑量的0.9%生理鹽水(NS),每周1次。其中半數(shù)模型動物于術后9周隨處死,剩下的動物于術后16周處死并獲取雙側膝關節(jié)標本。另外10只兔子作為對照,接受左膝關節(jié)假手術處理,并分別于術后9周及術后16周處死獲取標本。所有膝關節(jié)標本的股骨內(nèi)髁(MFC)、股骨外髁(LFC)、脛骨內(nèi)坪(MTP)以及脛骨外坪(LTP)分別進行大體評分及組織病理學Mankin評分。結果:假手術組膝關節(jié)軟骨股骨髁及脛骨坪軟骨未見明顯組織學破壞,軟骨表明光滑平整。所有進行ACLT的膝關節(jié)軟骨呈現(xiàn)出不同程度的軟骨損害改變。與安慰劑組相比,DHEA關節(jié)腔內(nèi)給藥在術后9周顯著減輕了膝關節(jié)雙側間室的軟骨退行性改變。與安慰劑組相比,DHEA關節(jié)腔內(nèi)給藥在術后16周僅僅減輕了膝關節(jié)外側間室軟骨破壞,而對內(nèi)側間室軟骨無明顯改善作用結論:DHEA對OA軟骨形態(tài)學改善作用具有時間依賴性和部位特殊性。DHEA對中期OA關節(jié)軟骨具有最為顯著的形態(tài)學改善作用。第三部分脫氫表雄酮對兔骨關節(jié)炎軟骨ADAMTS/TIMP-3酶系統(tǒng)的影響目的:觀察關節(jié)腔內(nèi)注射脫氫表雄酮(DHEA)對兔骨關節(jié)炎(OA)模型ADAMTS/TIMP-3酶系統(tǒng)的影響,并探討其作用機制。浙江大學博士學位論文方法:對經(jīng)過手術建模大白兔分為DHEA干預組和安慰劑組,股骨內(nèi)髁軟骨組織行羥脯氨酸(Hyp)及糖胺聚糖(GAG)含量測定,用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測關節(jié)軟骨中蛋白聚糖酶-1(ADAMTS-4/aggrecanase-1)、蛋白聚糖酶-2(ADAMTS-5/aggrecanase-2)、基質金屬蛋白酶組織抑制因子-3(TIMP-3)、轉化因子-β1(TGF-β1)、蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型膠原(Co11agenⅡ)的表達,用免疫印跡(Western blot)法檢測關節(jié)軟骨中Ⅱ型膠原及蛋白聚糖裂解片段(Aggrecan ARGxx)的表達。結果:DHEA處理可以顯著上調(diào)Hyp和GAG含量,下調(diào)ADAMTS-4、ADAMTS-5的 mRNA 表達,上調(diào) TIMP-3、TGF-β1、Aggrecan、Collagen Ⅱ 的 mRNA 表達,DHEA處理可以顯著抑制Aggrecan ARGxx的蛋白表達,并提高Collagen Ⅱ(2.28±0.69)蛋白表達。結論:DHEA對OA關節(jié)軟骨具有保護作用,可延緩OA的進展,其具體分子機制與正性調(diào)節(jié)ADAMTS/TIMP-3系統(tǒng)密切相關。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R684.3

【參考文獻】

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本文編號：1637374