本文選題：神經(jīng)肌肉接頭　切入點：出生后發(fā)育　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分 大鼠分娩性臂叢損傷模型肱二頭肌與前肢爪內(nèi)肌microRNA表達(dá)譜目的檢測大鼠分娩性臂叢損傷模型肱二頭肌與前肢爪內(nèi)肌microRNA表達(dá)譜,比較失神經(jīng)肱二頭肌與失神經(jīng)前肢爪內(nèi)肌差異表達(dá)nicroRNAs。方法7天齡SD幼鼠24只,體重13.3±1.5g,將右前肢全臂叢根性撕脫,以模擬分娩性臂叢損傷所導(dǎo)致的肱二頭肌與前肢爪內(nèi)肌失神經(jīng)肌萎縮。根據(jù)術(shù)后1、5、10、15周,隨機(jī)分為4組,每組6只。在相應(yīng)時間點,麻醉后應(yīng)用4%多聚甲醛灌注固定,取出全臂叢撕脫側(cè)和正常側(cè)(左側(cè))肱二頭肌與前肢爪內(nèi)肌,行Masson染色。觀察骨骼肌萎縮與膠原纖維增生,以此為根據(jù)選定microRNA表達(dá)譜檢測時間點。另取7天齡SD幼鼠9只,將右前肢全臂叢根性撕脫,于術(shù)后5周,麻醉后取出全臂叢撕脫側(cè)和正常側(cè)(左側(cè))肱二頭肌和前肢爪內(nèi)肌,應(yīng)用microRNA微陣列基因芯片檢測其microRNA表達(dá)譜,將正常肱二頭肌與失神經(jīng)肱二頭肌microRNA微陣列基因芯片結(jié)果相對照,正常前肢爪內(nèi)肌與失神經(jīng)前肢爪內(nèi)肌microRNA微陣列基因芯片結(jié)果相對照,分別獲得失神經(jīng)肱二頭肌差異表達(dá)microRNAs和失神經(jīng)前肢爪內(nèi)肌差異表達(dá)microRNAs。應(yīng)用熒光定量PCR對mcroiRNA微陣列基因芯片檢測出的6個差異表達(dá)microRNAs進(jìn)行驗證。結(jié)果在模擬分娩性臂叢損傷后5周時,失神經(jīng)肱二頭肌與失神經(jīng)前肢爪內(nèi)肌的肌纖維橫截面積維持率分別為52.3±18.5%和46.6±11.3,肌纖維橫截面積顯著減少。在10周時,失神經(jīng)肱二頭肌和前肢爪內(nèi)肌中膠原纖維/總面積分別為44.7±9.9%和71.6士7.2%,纖維結(jié)締組織增生顯著。模擬分娩性臂叢損傷后5周時,正常肱二頭肌與失神經(jīng)肱二頭肌microRNA微陣列基因芯片結(jié)果相對照,篩選出62個差異microRNAs,表達(dá)上調(diào)36個,表達(dá)下調(diào)26個；正常前肢爪內(nèi)肌與失神經(jīng)前肢爪內(nèi)肌microRNA微陣列基因芯片結(jié)果相對照,篩選出41個差異microRNAs,表達(dá)上調(diào)30個,表達(dá)下調(diào)11個。進(jìn)一步熒光定量PCR驗證結(jié)果顯示,模擬分娩性臂叢損傷后5周時,與正常肱二頭肌相比,失神經(jīng)肱二頭肌中miR-322-5p(1.6±0.3 vs 5.2±0.8, t=5.72, P0.05)、miR-495(1.3±0.2 vs 2.7±0.3,t=3.41, P0.05)表達(dá)下調(diào),miR-221-3p(2.7±0.3 vs 1.1±0.3,t=2.63,P0.05)表達(dá)上調(diào)；與正常前肢爪內(nèi)肌相比,失神經(jīng)前肢爪內(nèi)肌中miR-466b-1-3p(7.9±1.5 vs 1.4±0.3,t=5.83,P0.05)、miR-466b-2-3p(7.0±0.9 vs 1.2±0.4, t=3.93, P0.05)表達(dá)上調(diào), miR-30a-5p(1.2±0.3 vs 3.3±0.6,t=2.92,P0.05)表達(dá)下調(diào),以上結(jié)果均與相應(yīng) microRNA微陣列基因芯片結(jié)果相符合。結(jié)論在分娩性臂叢損傷5周的大鼠模型中,失神經(jīng)肱二頭肌和失神經(jīng)前肢爪內(nèi)肌有1nicroRNA異常表達(dá),且兩者之間差異顯著。揭示兩種肌肉差異表達(dá)microRNAs調(diào)節(jié)的靶基因所產(chǎn)生的作用,將有助于尋找造成兩種肌肉不可逆萎縮進(jìn)程差異的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)與關(guān)鍵蛋白。第二部分 大鼠分娩性臂叢損傷模型肱二頭肌與前肢爪內(nèi)肌差異表達(dá)microRNAs靶基因及其生物信息學(xué)分析目的 對大鼠分娩性臂叢損傷模型肱二頭肌與前肢爪內(nèi)肌差異表達(dá)的microRNAs,進(jìn)行靶基因預(yù)測并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。方法根據(jù)上一步microRNA微陣列基因芯片檢測結(jié)果,取模擬分娩性臂叢損傷后5周時失神經(jīng)肱二頭肌與正常肱二頭肌之間以及失神經(jīng)前肢爪內(nèi)肌與正常前肢爪內(nèi)肌之間的差異表達(dá)microRNAs,基于miRanda數(shù)據(jù)庫和Mirdb數(shù)據(jù)庫,進(jìn)行靶基因預(yù)測,取兩者交集得到差異表達(dá)nicroRNAs調(diào)控靶基因。根據(jù)Gene Ontology數(shù)據(jù)庫,對差異表達(dá)microRNAs調(diào)控靶基因進(jìn)行功能顯著性分析；根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫,對差異表達(dá)microRNAs調(diào)控靶基因進(jìn)行信號傳導(dǎo)通路分析。取顯著性功能所屬基因和生物信號傳導(dǎo)通路所屬基因交集,分別構(gòu)建出調(diào)控失神經(jīng)前肢爪內(nèi)肌和失神經(jīng)肱二頭肌相關(guān)microRNAs和基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用免疫熒光方法,對模擬分娩性臂叢損傷后5周時,肱二頭肌與前肢爪內(nèi)肌運動終板進(jìn)行形態(tài)觀察。結(jié)果模擬分娩性臂叢損傷后5周時,通過miRanda和Mirdb進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測,失神經(jīng)肱二頭肌差異表達(dá)microRNAs中分別得到靶基因數(shù)量為9538個和5249個,二者交集靶基因數(shù)量為2204個；失神經(jīng)前肢爪內(nèi)肌差異表達(dá)microRNAs中分別得到靶基因數(shù)量為6979個和4073個,二者交集靶基因數(shù)量為1143個。在模擬分娩性臂叢損傷后5周時失神經(jīng)肱二頭肌差異表達(dá)microRNAs調(diào)控靶基因中,上調(diào)靶基因顯著性功能在數(shù)據(jù)庫中富集程度(Enrichment)≥10的基因數(shù)目為33個,下調(diào)靶基因顯著性功能在數(shù)據(jù)庫中富集程度(Enrichment)≥10的基因數(shù)目為18個；有48條生物信號傳導(dǎo)通路受上調(diào)nicroRNAs 調(diào)控,有42條生物信號傳導(dǎo)通路受下調(diào)microRNAs調(diào)控。在模擬分娩性臂叢損傷后5周時失神經(jīng)前肢爪內(nèi)肌差異表達(dá)microRNAs調(diào)控的靶基因中,上調(diào)靶基因顯著性功能在數(shù)據(jù)庫中富集程度(Enrichment)≥10的基因數(shù)目為36個,下調(diào)的靶基因顯著性功能在數(shù)據(jù)庫中的富集程度(Enrichment)≥10的基因數(shù)目為42個；有17條生物信號傳導(dǎo)通路受上調(diào)microRNAs調(diào)控,有21條生物信號傳導(dǎo)通路受下調(diào)microRNAs調(diào)控。模擬分娩性臂叢損傷后5周時,失神經(jīng)前肢爪內(nèi)肌與失神經(jīng)肱二頭肌相比終板各參數(shù)減少顯著：整體終板周長減少程度,54.2±5.1% VS40.0±4.2%(t=2.97,P0.05)。染色區(qū)域終板周長減少程度,59.0±6.7% VS49.9±3.5%(t=2.87,P0.05)。整體終板面積減少程度,77.9±8.3% VS 52.6±6.3%(t=3.23,P0.05)。染色區(qū)域終板面積減少程度,82.1±6.0% VS 58.1±6.2%(t=3.11,P0.05)。終板的離散程度減少程度,19.6±5.0% VS 16.7±4.8%(t=2.98,P0.05)。標(biāo)準(zhǔn)化終板面積減少程度,46.4±5.4% VS 16.7±7.0%(t=4.98,P0.05)。結(jié)論在分娩性臂叢損傷5周大鼠模型中,失神經(jīng)肱二頭肌與前肢爪內(nèi)肌差異表達(dá)microRNAs的靶基因、其顯著性功能以及信號傳導(dǎo)通路之間存在較大差異。有較多的與神經(jīng)肌肉接頭相關(guān)的顯著性功能與信號傳導(dǎo)通路參與其中,且在上述兩種失神經(jīng)肌肉之間有較大差異。免疫熒光發(fā)現(xiàn),失神經(jīng)前肢爪內(nèi)肌內(nèi)運動終板退變程度更為嚴(yán)重。這些結(jié)果提示,失神經(jīng)后神經(jīng)肌肉接頭的不可逆退變是造成手內(nèi)肌功能難以修復(fù)的重要原因之一。揭示這兩種肌肉在神經(jīng)肌肉接頭組織結(jié)構(gòu)和發(fā)育進(jìn)程上差異,將有助于解釋產(chǎn)癱患兒手內(nèi)肌較肱二頭肌更早進(jìn)入不可逆萎縮的臨床現(xiàn)象。第三部分 正常大鼠肱二頭肌與前肢爪內(nèi)肌神經(jīng)肌肉接頭出生后發(fā)育差異目的尋找大鼠肱二頭肌與前肢爪內(nèi)肌神經(jīng)肌肉接頭在出生后發(fā)育過程中形態(tài)與煙堿樣乙酰膽堿受體亞基構(gòu)成上的差異。方法7天齡SD幼鼠12只,體重14.1±1.4g,10月齡成年SD大鼠12只,體重217.8±22.8,麻醉后,于體視顯微鏡下,將右側(cè)肱二頭肌與前肢爪內(nèi)肌取出,其中幼鼠與成年鼠各6只,通過免疫熒光技術(shù),分別對終板,突觸囊泡,運動神經(jīng)末梢和終末雪旺細(xì)胞實施特異性染色,在共聚焦顯微鏡下觀察神經(jīng)肌肉接頭形態(tài)。應(yīng)用ImageJ軟件對形態(tài)圖形進(jìn)行測量。透射電鏡觀察余下6只幼鼠和6只成年大鼠右側(cè)肱二頭肌與前肢爪內(nèi)肌神經(jīng)肌肉接頭超微結(jié)構(gòu)。另取新生SD大鼠36只,分別于出生后3天、7天、14天、21天、28天、35天,各隨機(jī)選取6只,取其雙側(cè)前肢爪內(nèi)肌與肱二頭肌,應(yīng)用熒光定量PCR動態(tài)檢測煙堿樣乙酰膽堿受體中胚胎亞基—Y亞基和成熟亞基—ε亞基mRNA的表達(dá)水平。另取6只成年大鼠作為成年表達(dá)水平對照。結(jié)果在突觸囊泡形態(tài)方面,出生后7天大鼠肱二頭肌與10月齡大鼠肱二頭肌在整體囊泡區(qū)域周長(39.3±3.2 VS 135.2±6.1,t=3.78,P0.05)、染色囊泡區(qū)域周長(61.2±5.75VS 282.1±18.5,t=4.12,P0.05)、整體囊泡區(qū)域面積(77.2±7.2 VS416.4±29.1,t=5.13,P0.05)、染色囊泡區(qū)域面積(35.8±3.3 VS 185.0±15.1,t=5.41,P0.05)4個參數(shù)中,兩者之間具有顯著性差異(P0.05),在囊泡離散程度(46.5±6.1VS 44.4±6.0,t=1.12,P0.05)兩者之間無顯著性差異；在10月齡前肢爪內(nèi)肌與7日齡前肢爪內(nèi)肌中上述5個參數(shù)均有顯著性差異(P0.05),整體囊泡區(qū)域周長(45.2±3.2 VS 198.2±8.7,t=3.90,P0.05)、染色囊泡區(qū)域周長(50.2±4.0 VS370.6±33.8,t=3.19,P0.05)、整體囊泡區(qū)域面積(85.8±5.1 VS 777.0±29.9,t=5.09,P0.05)、染色囊泡區(qū)域面積(68.4±3.6 VS 543.0±24.2,t=5.24,P0.05)、囊泡離散程度(79.7±8.5 VS 54.1±9.5,t=5.35,P0.05)。在運動神經(jīng)末梢方面,出生后7天大鼠肱二頭肌與10月齡大鼠肱二頭肌在神經(jīng)末梢分支全長(18.7±3.5 VS96.5±11.0,t=4.21,P0.05)、神經(jīng)末梢分支平均長度(2.7±0.8 VS 12.5±3.5,t=3.91,P0.05)、神經(jīng)末梢分支復(fù)雜度(1.5±0.5 VS 7.8±2.5,t=3.22,P0.05)這3個參數(shù)中,兩者之間具有顯著性差異；而神經(jīng)末梢分支數(shù)量(8.1±1.5 VS 7.2±1.2,t=1.02,P0.05),整體囊泡區(qū)域面積/神經(jīng)末梢分支全長(4.1±0.6 VS 4.3±0.3,t=1.28,P0.05)在10月齡肱二頭肌與7日齡肱二頭肌之間未見顯著性差異。在10月齡前肢爪內(nèi)肌與7日齡前肢爪內(nèi)肌中上述5個神經(jīng)末梢相關(guān)測量參數(shù)均具有顯著性差異(P0.05),神經(jīng)末梢分支全長(32.3±5.6 VS142.5±21.3,t=4.22,P0.05)、神經(jīng)末梢分支平均長度(2.5±1.3 VS 13.7±3.6,t=3.27,P0.05)、神經(jīng)末梢分支復(fù)雜度(4.7±1.2VS 16.2±3.5,t=4.46,P0.05)、神經(jīng)末梢分支數(shù)量(4.6±3.8 VS 11.3±2.5,t=2.98,P0.05),整體囊泡區(qū)域面積/神經(jīng)末梢分支全長(2.7±0.5 VS 5.5±0.9,t=2.78,P0.05)。在終末雪旺細(xì)胞數(shù)量方面,成年大鼠肱二頭肌(2.2±0.6)與7日齡肱二頭肌(4.1±0.7)中可見顯著性差異(t=3.99,P0.05)；10月齡前肢爪內(nèi)肌(5.3±0.5)與7日齡前肢爪內(nèi)肌(1.6±0.8)中亦可見顯著性差異(t=3.48,P0.05)。在終板形態(tài)方面,出生后7天大鼠肱二頭肌與10月齡大鼠肱二頭肌,在整體終板周長(48.7±4.3 VS 115.1±5.3,t=3.12,P0.05),染色區(qū)域終板周長(78.3±6.5 VS181.1±7.2,t=3.45,P0.05),整體終板面積(90.7±6.3 VS 454.1±11.7,t=2.34,P0.05),染色區(qū)域終板面積(50.2±4.3 VS 250.4±9.5,t=5.31,P0.05)方面兩者之間具有顯著性差異。而在終板離散程度(54.8±4.8 VS 55.1±6.1,t=-0.72,P0.05)與標(biāo)準(zhǔn)化終板面積(7.3±0.5 VS 7.7±0.5,1.21,P0.05)方面無明顯差異；出生后7天大鼠前肢爪內(nèi)肌與10月齡大鼠前肢爪內(nèi)肌相比,在整體終板周長(46.0±2.4 VS135.2±5.1,t=2.98,P0.05),染色區(qū)域終板周長(55.1+3.5 VS 320.2±10.9,t=3.21,P0.05),整體終板面積(101.1±9.6 VS 796.4±15.1,t=3.47,P0.05),染色區(qū)域終板面積78.2±5.1 VS 616.2±13.2,t=2.98,P0.05),以及終板離散程度(77.4±6.1 VS64.1±8.0,t=3.24,P0.05)與標(biāo)準(zhǔn)化終板面積(10.6±1.8 VS 22.8+1.3,t=3.78,P0.05)方面均有顯著性差異。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),在出生后7天大鼠前肢爪內(nèi)肌神經(jīng)肌肉接頭,終末雪旺細(xì)胞體積較大,神經(jīng)末梢約2/3被其包裹,神經(jīng)末梢數(shù)量較多,但直徑較小,內(nèi)含突觸囊泡較少,僅發(fā)現(xiàn)有初級突觸裂隙,次級突觸裂隙正在形成中。在出生后7天大鼠肱二頭肌神經(jīng)肌肉接頭中,終末雪旺細(xì)胞體積較大,神經(jīng)末梢較大面積被其包裹,其內(nèi)含有多個神經(jīng)末梢,但直徑稍大,內(nèi)含突觸囊泡較多,可見初級突觸裂隙與較為淺表的次級突觸裂隙。在大鼠肱二頭肌中,出生后3天(1.3±0.7),7天(1.7±0.2),14天(2.4±0.4)￡亞基mRNA表達(dá)量逐漸上升,出生后21天(1.8±0.4),28天(1.3±0.2)ε亞基mRNA表達(dá)量逐漸下降,35天(1.3±0.2)達(dá)到成年￡亞基mRNA表達(dá)量水平(1.3±0.3)；出生后3天(1.0±0.1),7天(0.9±0.2),14天(0.3±0.1)均檢測到γ亞基mRNA表達(dá)量,呈緩慢下降趨勢,21天之后未檢測到γ亞基mRNA表達(dá)。在大鼠前肢爪內(nèi)肌中,出生后3天時未檢測到ε亞基mRNA表達(dá)量,出生后7天(0.8±0.2),14天(1.5±0.5),21(2.9±0.9)天可檢測到￡亞基mRNA,表達(dá)量逐漸上升；28天時(1.8±0.3)￡亞基mRNA表達(dá)量有所回落,35天時(1.2±0.3)達(dá)到成年￡亞基mRNA表達(dá)量水平(1.3±0.2)；出生后3天(5.0±0.8),7天(4.3±0.5),14天(4.0±0.6),21天(1.4±0.5),28天(0.6±0.2)時均檢測到γ亞基mRNA表達(dá)量,呈緩慢下降趨勢,到出生后35天時與成年水平一致,均未能檢測到γ亞基mRNA表達(dá)量。結(jié)論在大鼠中,前肢爪內(nèi)肌神經(jīng)肌肉接頭出生后結(jié)構(gòu)發(fā)育進(jìn)程顯著延遲于肱二頭肌。其原因可能在于,相對于肱二頭肌而言,前肢爪內(nèi)肌出生后運動功能發(fā)育具有延遲性。前肢爪內(nèi)肌神經(jīng)肌肉接頭的這種出生后發(fā)育特點,可能導(dǎo)致其在失神經(jīng)條件下,較肱二頭肌的神經(jīng)肌肉接頭更具有易損性。這些結(jié)果為尋找導(dǎo)致上述兩種肌肉失神經(jīng)萎縮進(jìn)程差異的關(guān)鍵因子提供重要線索。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R651.3;R-332

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本文編號：1616159