本文選題：熱休克蛋白65　切入點：ApoE基因缺失小鼠　出處：《南方醫(yī)科大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：一、研究背景 動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是導致冠心病或腦卒中的主要原因之一,其主要是以血管內(nèi)皮細胞損傷、血脂代謝異常為基礎(chǔ)、以血管慢性炎癥免疫反應(yīng)為特征。既往流行病學研究和動物實驗表明,血漿高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)水平與動脈粥樣硬化及冠心病風險呈高度負相關(guān)關(guān)系,血清HDL-C水平是預(yù)測心血管事件發(fā)生率的重要指標。HDL是一種脂質(zhì)和蛋白含量大致均等的異質(zhì)性脂蛋白,具有重要的保護心血管病的功能,主要包括促進逆膽固醇轉(zhuǎn)運(reverse cholesterol transport, RCT)、抗炎、抗氧化、抗血栓形成、增強內(nèi)皮功能、改善糖尿病的血糖控制情況以及抑制造血干細胞增殖等,其中HDL的促RCT和抗炎抗氧化功能尤為重要。 然而最近有大量研究證實,HDL-C水平高低并不能準確代表HDL的整體功能,HDL-C水平檢測作為HDL功能的度量標準以及預(yù)測冠心病發(fā)病風險的生物指標存在明顯的局限性。在多種因素所致的慢性炎癥及急性期反應(yīng)的狀態(tài)下,HDL的結(jié)構(gòu)和成分會發(fā)生修飾及改變,其原有的正常功能會發(fā)生缺失,甚至表現(xiàn)出與其正常功能相反的作用,主要表現(xiàn)為抗炎抗氧化等功能下降,甚至轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺�、促氧化和抑制RCT等促AS的作用。因此,研究HDL功能的改變對預(yù)測AS及冠心病風險更為重要。 HDL的抗氧化功能主要與它結(jié)合的屏氧酶1(paraoxonasel, PON1)有關(guān),臨床研究表明,PON1活性低的人群患AS的概率高于PON1活性高的人群。另外,髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)作為一種由中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞分泌的白細胞酶,亦與HDL抗氧化功能相關(guān)。MPO及其氧化產(chǎn)物可氧化修飾載脂蛋白A-I (apoA-I),從而改變HDL功能。因此通過檢測PON1活性及MPO活性可較好的反映HDL的抗氧化功能。巨噬細胞的膽固醇流出是RCT的第一步也是關(guān)鍵步驟,2011年Khera等的研究表明HDL介導的促RCT功能可獨立于HDL-C水平更好地預(yù)測AS及冠心病發(fā)生風險[6]。由此可知,檢測膽固醇流出率、PON1活性及MPO活性對全面評估HDL的功能改變及AS的發(fā)生發(fā)展有重要意義。 研究表明,炎癥和免疫反應(yīng)在AS各個階段起重要作用,熱休克蛋白65(heat shock protein65, HSP65)作為分枝桿菌主要抗原之一,具有很強的免疫原性,而且在感染機體時高度表達,并被免疫系統(tǒng)識別,在AS形成中具有重要作用。大量研究證明,免疫HSP65的小鼠其AS的損害及斑塊面積明顯增大,斑塊內(nèi)促炎細胞因子含量增加,表明HSP65可通過炎癥免疫反應(yīng),促進AS的發(fā)生發(fā)展。亦有研究表明炎癥刺激可引起HDL功能發(fā)生改變,但目前國內(nèi)外關(guān)于HSP65對HDL功能的影響研究較少,皮下免疫HSP65引起炎癥免疫反應(yīng)的同時是否會影響HDL的促膽固醇逆轉(zhuǎn)運及抗炎抗氧化功能尚不明確。因此,我們通過皮下免疫HSP65,觀察不同劑量HSP65對載脂蛋白E基因缺失(apolipoprotein E gene knocked-out,ApoE-/-)小鼠HDL促膽固醇逆轉(zhuǎn)運及抗炎抗氧化功能相關(guān)的巨噬細胞膽固醇流出率、炎癥指數(shù)、血清PON1活性、MPO活性等的影響,以進一步探討HSP65和HDL功能改變之間的關(guān)系及其可能的機制。 二、研究目的 本研究采用高脂飲食喂養(yǎng)ApoE基因缺失小鼠構(gòu)建動脈粥樣硬化模型,觀察不同劑量HSP65對HDL抗炎抗氧化功能及巨噬細胞膽固醇流出率的影響,并進一步探索HSP65影響巨噬細胞膽固醇流出率的可能機制。 三、研究方法 1、動物分組及干預(yù) 8只8周齡C57BL/6J小鼠給予普通飼料喂養(yǎng)作為正常組,24只8周齡ApoE-/-隨機分為磷酸鹽緩沖液(PBS)組、5μg HSP65組及25μg HSP65組,每組8只小鼠。ApoE-/-小鼠分別予以高脂飼料喂養(yǎng),并在第3周和第6周分別于小鼠背部皮下注射PBS、5μgHSP65或25μg HSP65。第16周進行實驗。 2、血脂檢測 實驗的第16周,小鼠空腹12h狀態(tài)下,乙醚麻醉后心臟采血,3000r/min離心10min取血清,置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎妹阜ㄔ谌詣由瘍x上測定血清總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)含量。 3、血清HSP65抗體及白介素-10和干擾素-γ含量測定 小鼠血清HSP65抗體采用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)法測定。血清白介素-10(IL-10)和干擾素-γ (IFN-γ)含量嚴格根據(jù)美國Assay公司提供的試劑盒說明書采用ELISA法檢測。 4、HDL抗炎抗氧化功能和外周腹腔巨噬細胞膽固醇流出率檢測 收集實驗第16周的血清標本,采用乙酸苯酯法測定屏氧酶1(PON1)活性；采用MPO試劑盒在分光光度計上測定髓過氧化物酶(MPO)活性；采用非細胞學法測定高密度脂蛋白炎癥指數(shù)(high density lipoprotein inflammatory index, HⅡ;利用液閃計數(shù)儀檢測巨噬細胞[3H]膽固醇流出率。 5、肝組織SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ及LXR-a mRNA表達水平檢測 肝組織總RNA的提取采用Trizol提取法,實時熒光定量PCR (RT-PCR)進行相對定量檢測肝臟SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ及LXR-α mRNA的表達量。 6、肝組織和腹腔巨噬細胞SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ及LXR-α蛋白表達水平檢測 用RIPA裂解液裂解小鼠肝組織和提取的腹腔巨噬細胞,BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白質(zhì)定量,利用Western blot蛋白免疫印跡法測定肝臟和腹腔巨噬細胞SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ及LXR-α蛋白的表達量。 7、病理組織學觀察主動脈斑塊形成情況 實驗第16周心臟采血后,分離小鼠整條主動脈,10%中性甲醛固定液固定,常規(guī)制組織石蠟切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,顯微鏡下觀察其組織病理改變,應(yīng)用Image-plus6.0專業(yè)圖像分析軟件分析主動脈斑塊面積。 8、統(tǒng)計學處理 所有計量資料均以均數(shù)±標準差(x±s)表示,并采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行兩樣本均數(shù)比較的獨立樣本t檢驗分析,多組間總體均數(shù)比較,在方差齊時采用單向方差分析(one-way ANO VA),方差不齊時采用Welch校正檢驗。多個樣本均數(shù)間的多重比較方差齊時采用LSD法檢驗,方差不齊時采用Dunnett's T3檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 四、研究結(jié)果 1.各組小鼠血脂水平的比較 與正常組相比,PBS組、5μgHSP65組和25μgHSP65組血清TC、TG、LDL-C水平均明顯升高(P0.05),HDL-C水平降低(P0.05),差異有統(tǒng)計學意義；PBS組、5μgHSP65組和25μgHSP65組之間TC、TG、LDL-C水平比較,無明顯差異,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；25μgHSP65組與PBS組比較,HDL-C水平明顯降低(P0.05)。 2.各組小鼠血清HSP65抗體及炎癥因子的比較 PBS組與正常組相比,血清抗HSP65抗體滴度無明顯差異(0.22±0.05vs0.19±0.03,P0.05)；與PBS組相比,5μgHSP65組小鼠血清HSP65抗體水平(0.55±0.15vs0.22±0.05,P0.05)升高,差異有統(tǒng)計學意義；與5μgHSP65組相比,25μgHSP65組小鼠血清HSP65抗體水平(1.08±0.24vs0.55±0.15,P0.05)顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義。 PBS組與正常組相比,血清IL-10含量無明顯差異[(338.54±45.16)ng/L vs (350.98±56.87)ng/L, P0.05];5μgHSP65組和PBS組相比,血清IL-10水平為[(303.55±42.47)ng/L vs (338.54±45.16)ng/L, P=0.15],差異無統(tǒng)計學意義；25μgHSP65組和PBS組相比,血清IL-10水平[(253.76±45.06)ng/L vs (338.54±45.16)ng/L, P0.05]顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義；25μgHSP65組和5μgHSP65組相比[(253.76±45.06)ng/L vs (303.55±42.47)ng/L, P=0.04],血清IL-10水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義。 PBS組與正常組相比,血清IFN-y含量無明顯差異[(121.01±21.48)ng/L vs (116.91±18.06)ng/L, P0.05];5μgHSP65組和PBS組相比,血清IFN-y水平[(139.34±11.43)ng/L vs (121.01±21.48)ng/L, P=0.04]升高,差異有統(tǒng)計學意義；25μgHSP65組和PBS相比,血清IFN-y水平[(185.06±13.80)ng/L vs (121.01±21.48)ng/L, P0.05]顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義；25μgHSP65組和5μgHSP65組相比[(185.06±13.80)ng/L vs (139.34±11.43)ng/L, P0.05],血清IFN-y水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義。 3.各組小鼠巨噬細胞膽固醇流出率及HDL抗炎抗氧化功能的比較 PBS組巨噬細胞膽固醇流出率明顯低于正常組[(17.98±1.67)%vs(21.83±1.54)%,P0.05],差異有統(tǒng)計學意義；5μgHSP65組和PBS組相比,膽固醇流出率[(15.17±1.14)%vs(17.98±1.67)%,P0.05]降低,差異有統(tǒng)計學意義；25μgHSP65組和5μgHSP65組相比,膽固醇流出率[(12.52±0.69)%vs(15.17±1.14)%,P0.05]顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義。 PBS組HDL炎癥指數(shù)較正常組升高[(1.03±0.10)vs(0.66±0.11),P0.05],差異有統(tǒng)計學意義；5μgHSP65組和PBS組相比,血清HDL炎癥指數(shù)[(1.21±0.09)vs(1.03±0.10),P0.05]升高,差異有統(tǒng)計學意義；25μgHSP65組和5μgHSP65組相比,HDL炎癥指數(shù)[(1.34±0.11)vs(1.21±0.09),P=0.04]顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義。 與正常組比較,PBS組PON1活性下降[(66.32±10.80)U/mL vs (80.75±14.52)U/mL, P=0.02],差異有統(tǒng)計學意義；5μgHSP65組和PBS組相比,血清PON1活性為[(55.40±6.68)U/mL vs (66.32±10.80)U/mL, P0.05],差異無統(tǒng)計學意義;25μgHSP65組和PBS組相比,血清PON1活性[(49.90±10.30)U/mL vs (66.32±10.80)U/mL, P0.05]顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義；25μgHSP65組和5μgHSP65組相比[(49.90±10.30)U/mL vs (55.40±6.68)U/mL, P0.05],血清PON1活性差異無統(tǒng)計學意義。 PBS組MPO活性較正常組升高[(37.98±2.88)U/L vs(31.47±2.78)U/LP0.05],差異有統(tǒng)計學意義；5μgHSP65組和PBS組相比,血清MPO活性為[(40.68±3.60)U/L vs (37.98±2.88)U/L, P0.05],差異無統(tǒng)計學意義；25μgHSP65組和PBS組相比,血清MPO活性[(53.10±5.10)U/L vs (37.98±2.88)U/L, P0.05]顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義；25μgHSP65組和5μgHSP65組相比[(53.10±5.10)U/L vs (40.68±3.60)U/L, P0.05],血清MPO活性差異有統(tǒng)計學意義。 4.各組肝組織SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ和LXR-α mRNA相對表達量 與正常組比較,PBS組SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ和LXR-α mRNA表達量均明顯降低(P0.05),差異有統(tǒng)計意義；與PBS組比較,5μgHSP65組SR-B1ABCG1和PPAR-γ mRNA表達量均明顯降低(P0.05),差異有統(tǒng)計學意義；而5μgHSP65組ABCA1和LXR-α mRNA表達量與PBS組相比較無明顯差異(P0.05),差異無統(tǒng)計意義；與PBS組比較,25μgHSP65組SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ和LXR-a mRNA表達量均明顯降低(P0.05),差異有統(tǒng)計意義；與5μgHSP65組比較,25μgHSP65組ABCG1, PPAR-γ和LXR-α mRNA表達量明顯降低(P0.05),差異有統(tǒng)計意義。 5.各組肝組織SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-y和LXR-a蛋白表達情況 與正常組比較,PBS組肝組織SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ和LXR-α蛋白表達量均明顯降低(P0.05),差異有統(tǒng)計意義；與PBS組相比,5μgHSP65組肝組織SR-B1, ABCA1和ABCG1蛋白表達量明顯減少(P0.05),差異均有統(tǒng)計意義；而5μgHSP65組PPAR-γ和LXR-α蛋白表達量與PBS組相比較無明顯差異(P0.05),差異無統(tǒng)計意義；與PBS組比較,25μgHSP65組SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ和LXR-α蛋白表達量均明顯降低(P0.05),差異有統(tǒng)計意義；25μgHSP65組和5μgHSP65組相比,SR-B1, ABCA1, PPAR-γ和LXR-α蛋白表達量明顯減少(P0.05),差異均有統(tǒng)計意義。 6.各組巨噬細胞SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ和LXR-α蛋白表達情況 與正常組比較,PBS組巨噬細胞SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ和LXR-α蛋白表達量均明顯降低(P0.05),差異有統(tǒng)計意義；與PBS組相比,5μgHSP65組巨噬細胞SR-B1, ABCA1, ABCG1和PPAR-γ蛋白表達量明顯減少(P0.05),差異均有統(tǒng)計意義；而5μgHSP65組巨噬細胞LXR-α蛋白表達量與PBS組相比較無明顯差異(P0.05),差異無統(tǒng)計意義；與PBS組比較,25μgHSP65組SR-B1,ABCA1, ABCG1, PPAR-γ和LXR-α蛋白表達量均明顯降低(P0.05),差異有統(tǒng)計意義；25μgHSP65組和5μgHSP65組相比,ABCA1, ABCG1和LXR-α蛋白表達量明顯減少(P0.05),差異均有統(tǒng)計意義。 7.各組小鼠主動脈粥樣斑塊面積的比較 與正常組相比,PBS組、5μgHSP65組和25μgHSP65組斑塊明顯,血管腔縮��；與PBS組相比,5μgHSP65組小鼠的斑塊面積[(221636.3±86751.70)μm2vs (88918.88±46369.33)μm2, P0.01)明顯增多,差異有統(tǒng)計意義；與5μgHSP65組相比,25μgHSP65組小鼠的斑塊面積[(385120.6±97695.11)μm2vs (221636.3±86751.70)μm2,P0.01]明顯增多,差異有統(tǒng)計意義。 五、結(jié)論 1.HSP65可誘導炎癥免疫反應(yīng),升高促炎因子IFN-γ濃度,降低抑炎因子IL-10濃度,使輔助性T細胞(Thl和Th2)功能失衡,在AS的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。 2.HSP65誘導炎癥免疫反應(yīng)的同時損害了HDL的功能,可降低巨噬細胞膽固醇流出率,升高HDL炎癥指數(shù)和MPO活性,降低PON1活性,且隨著HSP65劑量的增加,對HDL功能的影響愈加明顯。 3.HSP65可通過下調(diào)肝臟和巨噬細胞SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ和LXR-α的表達而降低巨噬細胞的膽固醇流出率,進一步加速AS的發(fā)生發(fā)展。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R543.5

【參考文獻】

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1 楊軍;吳小慶;薄小萍;謝平;穆會君;;人熱休克蛋白65檢測在冠心病中的應(yīng)用價值[J];臨床心血管病雜志;2011年07期

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本文編號：1607846